鄧蓓蓓，王貴軍，王玉彬，李迪諾，李 諶

1遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 婦科，遼寧錦州 121001；2遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 普外科，遼寧錦州 121001；3遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 遼寧省醫(yī)學組織工程重點實驗室，遼寧錦州 121001

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors，GISTs)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤1%~4%，近十年來，無論是基礎(chǔ)研究還是臨床治療領(lǐng)域，對其臨床特點、病理改變、免疫表型、遺傳學特征已清晰。然而在腫瘤的發(fā)病機制、生物學行為預(yù)測、藥物治療等方面還有許多問題尚待解決[1]，如何控制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移仍是其治療面臨的主要問題[2-3]。組織因子途徑抑制物 2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)在多種腫瘤中表達下調(diào)，與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[4-5]。我們采用免疫組織化學、RT-PCR和Western blot方法檢測胃間質(zhì)瘤組織中TFPI-2的表達，探討其與胃間質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期為治療胃間質(zhì)瘤及改善其預(yù)后提供新思路。

材料和方法

1 標本收集 收集我院2006年1月-2012年4月手術(shù)切除的新鮮胃間質(zhì)瘤標本72例，男35例，女37例，年齡33~78歲，中位年齡56.4歲；腫瘤侵襲臨近器官或組織，或有遠處轉(zhuǎn)移者20例，無侵襲轉(zhuǎn)移者52例。取材在手術(shù)標本離體30 min內(nèi)進行，每例均取腫瘤中心處非壞死瘤組織、腫瘤旁組織和正常組織，標本立即置于-80 ℃冰箱保存。胃間質(zhì)瘤診斷標準：常規(guī)形態(tài)符合GISTs診斷要點，免疫組織化學CD117陽性；或常規(guī)形態(tài)符合GISTs診斷要點，CD117陰性而CD34陽性；或常規(guī)形態(tài)符合GISTs診斷要點，CD117、CD34陰性，并且平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)、結(jié)蛋白(desmin)、神經(jīng)脊突細胞抗原(S-100)蛋白也均陰性，排除平滑肌源性和神經(jīng)源性腫瘤。依據(jù)Fletcher等[6]提出的GISTs生物學行為分級標準進行分級(NIH分級)：腫瘤直徑＜2 cm和核分裂相＜5/50 HPF為極低度侵襲危險性(Ⅰ級)；腫瘤直徑2~5 cm和核分裂相＜5/50 HPF為低度侵襲危險性(Ⅱ級)；腫瘤直徑5~10 cm和核分裂相＜5/50 HPF或腫瘤＜5cm和核分裂相6~10/50 HPF為中度侵襲危險性(Ⅲ級)；腫瘤直徑＞5 cm和核分裂相＞5/50 HPF或腫瘤＞10 cm或核分裂相＞10/50 HPF為高度侵襲危險性(Ⅳ級)。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

2 免疫組化測定 將收集的組織石蠟包埋制成4 μm厚的切片，免疫組化染色步驟按試劑盒(sp0023，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)說明書進行。TFPI-2一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)稀釋比例為1∶400。免疫組化著色強度評分：0分為無；1分為弱；2分為強。陽性細胞評分按百分率遞增：0分為＜5%；1分為≥5%，＜10%；2分為≥10%，＜30%；3分為≥30%，＜50%；4分為≥50%。著色強度計分與陽性細胞率計分之乘積為該病例評分值，評分值≤2分為陰性；≥3分為陽性。

3 RT-PCR測定 取每部位組織200 mg，提取總RNA。取2 μg總RNA，采用一步(One Step)RT-PCR法，根據(jù)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明操作，TFPI-2和β-actin的上、下游引物均由上海生工生物工程有限公司合成，人類TFPI-2的PCR上、下游引物分別為5'-TCTGCCAATGTGACTCGC TAT-3'和 5'-TATTGTCATTCCCTCCACAGC-3'，合成產(chǎn)物為88bp，β-actin的上、下游引物分別為5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'和5'-AAGGAAGG CTGGAAGAGTGC-3'，合成產(chǎn)物為216bp。按下述條件進行循環(huán)：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃2 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后進行30個周期的PCR擴增反應(yīng)，每個周期為94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。TFPI-2和β-actin的反應(yīng)條件相同。PCR擴增產(chǎn)物在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下照相并保存。

4 Western blot測定 取200 mg組織塊置于勻漿器中球狀部位，用剪刀將組織塊盡量剪碎。加400 μl裂解液，裂解30 min后在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清測蛋白濃度后分裝于0.5 ml離心管中，樣品中加入緩沖液于沸水中煮5 min使蛋白變性。SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠80 V，分離膠150 V，將凝膠中的蛋白用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至0.45 μm的PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，然后分別加入兔抗人的TFPI-2和β-actin抗體，置于4 ℃冰箱搖床孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗1∶1 000，于室溫孵育60 min，洗膜后放入暗盒顯色。

5 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以表示，兩樣本間均數(shù)比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，計數(shù)數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 免疫組化測定 陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒，主要位于胞漿。TFPI-2蛋白在正常組織、瘤旁組織及瘤中心處組織中均有表達，但在正常組織中的表達要強于瘤旁組織及瘤中心處組織，瘤旁組織中的表達亦強于瘤中心處組織(圖1)。瘤組織中TFPI-2的陰性表達率在性別和年齡上無統(tǒng)計學差異，在腫瘤有無侵襲轉(zhuǎn)移上存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，見表1。

表1 TFPI-2蛋白表達與性別、年齡、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系Tab.1 Relation of TFPI-2 protein expression with gender and age of patients, tumor invasion and metastasis(n, %)

2 RT-PCR測定 TFPI-2 mRNA在正常組織及瘤旁組織中高表達，在瘤中心組織中低表達(P＜0.01，圖2，表2)。在瘤組織中的表達水平隨NIH分級增高而下調(diào)(P＜0.01)。TFPI-2 mRNA表達在性別和年齡上無統(tǒng)計學差異，在腫瘤有無侵襲轉(zhuǎn)移上存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，見表3。

3 Western blot測定 TFPI-2蛋白在正常組織及瘤旁組織中高表達，在瘤中心組織中低表達(P＜0.01，圖3，表2)。在瘤組織中的表達水平隨NIH分級增高而下調(diào)(P＜0.01)。TFPI-2蛋白表達在性別和年齡上無統(tǒng)計學差異，在腫瘤有無侵襲轉(zhuǎn)移上存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，見表3。

表2 TFPI-2在不同部位的表達情況Tab.2 TFPI-2 mRNA and protein expression in different tissues

表3 瘤組織TFPI-2的表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between TFPI-2 expression and clinicopathologic characteristics of gastric stromal tumor

圖1 TFPI-2蛋白在瘤組織、瘤旁組織和正常組織中的表達(×400) A:正常組織； B:瘤旁組織； C:瘤組織Fig.1 TFPI-2 protein expression in normal gastric tissue (A), adjacent stromal tumor tissue (B) and stromal tumor tissue (C) (×400)

圖2 TFPI-2 mRNA在瘤組織、瘤旁組織和正常組織中的表達1: Marker; 2:瘤組織; 3: 瘤旁組織; 4: 正常組織Fig.2 TFPI-2 mRNA expression in tumor tissue, its adjacent tissue and normal tissue 1: Marker; 2:Tumor tissue; 3: Adjacent tumor tissue; 4: Normal tissue

圖3 TFPI-2蛋白在瘤組織、瘤旁組織和正常組織中的表達1: 瘤組織; 2: 瘤旁組織; 3: 正常組織Fig.3 Protein expression of TFPI-2 at center and periphery of tumor and at nearby normal tissue 1: Tumor tissue; 2: Adjacent tumor tissue;3: Normal tissue

討 論

局限性GIST的生物學行為目前主要依據(jù)腫瘤大小和核分裂象數(shù)評估其惡性危險程度，本研究采用Fletcher等提出的按危險程度分為極低、低、中和高4級分類方案。研究發(fā)現(xiàn)，TFPI-2不但在瘤組織、瘤旁組織和正常組織中表達有差異，在不同級別中的表達也存在統(tǒng)計學差異。另外，我們發(fā)現(xiàn)在腫瘤有無侵襲或轉(zhuǎn)移上，TFPI-2的表達也存在差異，腫瘤有侵襲或轉(zhuǎn)移者，TFPI-2的表達明顯下降。

TFPI-2是絲氨酸蛋白酶抑制物，能有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、組織蛋白酶等多種蛋白水解酶的活性，已有實驗證實，TFPI-2能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、肺癌[8]、前列腺癌[9]、喉癌[10]、胰腺癌[11]等細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果表明，TFPI-2的表達在腫瘤組織及瘤旁組織中受到抑制，這一變化表明細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性可能因TFPI-2的抑制而降低。胃間質(zhì)瘤中心組織TFPI-2的表達水平隨著NIH分級升高而下調(diào)，并且TFPI-2表達在腫瘤有無侵襲轉(zhuǎn)移上存在統(tǒng)計學差異，提示TFPI-2低表達可能促進胃間質(zhì)瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移，導致預(yù)后不良。其可能的機理是，TFPI-2基因表達產(chǎn)物TFPI-2蛋白抑制多種蛋白水解酶的活性，降低蛋白水解酶對細胞外基質(zhì)的破壞，而各種腫瘤細胞分泌的蛋白水解酶所參與的細胞外基質(zhì)的降解正是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。另有研究[12]表明，TFPI-2基因表達對絨癌細胞的生長抑制可通過誘導細胞凋亡來實現(xiàn)，在胃間質(zhì)瘤是否也是如此還需進一步實驗證實。

綜上所述，TFPI-2基因可能在胃間質(zhì)瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，這為我們提供新的思路來判斷胃間質(zhì)瘤的惡性程度、預(yù)測轉(zhuǎn)移及評估胃間質(zhì)瘤患者的預(yù)后，相信隨著研究的不斷深入、廣泛，TFPI-2在胃間質(zhì)瘤的預(yù)防、診斷及基因治療中將會有更美好的前景。

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