周 任

（廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院肝膽外科 537000）

肝癌是一種臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率在消化系統(tǒng)腫瘤中僅次于胃癌和食管癌，位居第3，并且發(fā)病率在中國(guó)逐漸升高，嚴(yán)重影響了人民群眾的身體健康［1］。連接蛋白（Cx）是由連接基因家族編碼的一組蛋白質(zhì)，其作為細(xì)胞間隙連接通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)到死亡的全部生命過(guò)程，具有重要的調(diào)控作用［2］。研究表明肝癌與Cx表達(dá)異常有關(guān)，但是具體的機(jī)制還不太清楚［3］。因此，了解間隙連接基因Cx32的調(diào)節(jié)機(jī)制，恢復(fù)正常表達(dá)是目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一［4］。本文為此應(yīng)用蛋白雜交，RT－PCR分別檢肝細(xì)胞癌、肝炎組織和正常肝組織中Cx32蛋白及Cx32mRNA水平，以探討間隙連接基因Cx32在肝細(xì)胞癌與肝炎中的表達(dá)意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本和試劑 收集本院2008年2月至2011年3月30例肝細(xì)胞癌及30例肝炎標(biāo)本，都為外科手術(shù)切除標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。所有病例術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放療和化療。其中，男40例，女20例，年齡28～62歲，平均（45.25±8.24）歲。30例正常肝組織標(biāo)本為同期醫(yī)院收治的外科外傷性肝破裂患者的手術(shù)切除標(biāo)本，并除外其他肝臟疾病，其中，男20例，女10例，年齡25～60歲，平均（45.85±6.82）歲。所有標(biāo)本取下后用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，均在離體后0.5h內(nèi)置入－196℃的液氮中保存。試劑：Cx32鼠抗人單克隆抗體（美國(guó)zymed公司），β－actin鼠抗人單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），ECL試劑盒（Pharmacia公司），Trizol（美國(guó) MRC公司），AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），PCR引物（大連寶生物工程公司），Taq酶（大連寶生物工程公司）。

1.2 引 物 設(shè) 計(jì) Cx32上 游 引 物：5′－CAG CTT GTT GAT CTC ATT CTG C－3′，下游引物：5′－GCA TCA TCC TCA ATG TGG C－3′，目的片段長(zhǎng)度 150bp；β－actin上游引物：5′－ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A－3′，下 游 引 物：5′－CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA－3′，目的片段長(zhǎng)度318bp。

1.3 蛋白雜交分析 用RIPA buffer提取蛋白質(zhì)，DC protein assay法測(cè)定總蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)行SDS－PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉后，加鼠抗人Cx32單克隆抗體（1∶500），HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶10 000），ECL試劑盒檢測(cè)Cx32蛋白信號(hào)。Bandscan9.0軟件進(jìn)行灰度值掃描分析。

1.4 RT－PCR分析 分別取上述3種組織50～100mg于勻漿器內(nèi)，加1mL Trizol反復(fù)抽吸勻漿，裂解后倒入1.5mL EP管內(nèi)；加入氯仿0.2mL，劇烈搖擺15s后置于室溫下10min；4℃離心，12 000r／min離心15min；取上層液相置于另一1.5 mL EP管內(nèi)；加入0.5mL異丙醇混勻，室溫下放105min；4℃離心，12 000r／min離心10min，棄去上清液；加入75%乙醇1mL，混勻后4℃離心，12 000r／min離心5min；棄去上清，將EP管倒置，干燥10min左右；加入20μL DEPC水溶解；按照常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按以下配制PCR反應(yīng)液（總反應(yīng)體系50μL）：5×PCR Buffer 10μL，滅菌蒸餾水28.75μL，TaKa－Ra ExTap 0.25μL，上、下游特異性引物各0.5μL和cDNA 10 μL。放入PCR儀內(nèi)，按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為58℃，延伸時(shí)間1min。同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)物：GAPDH。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5～10μL反應(yīng)產(chǎn)物行0.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外線下成像。用Bandscan5.0軟件進(jìn)行灰度掃描分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，所有結(jié)果以表示，計(jì)量均數(shù)資料比較用方差分析，有顯著差異者再進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白雜交結(jié)果 灰度掃描與灰度值結(jié)算結(jié)果分析顯示肝癌組織Cx32蛋白雜交產(chǎn)物灰度值顯著低于正常肝組織（P＜0.01），并顯著低于肝炎組織（P＜0.05）。具體情況見(jiàn)表1。

表1 3組間Cx32蛋白雜交檢測(cè)產(chǎn)物灰度值比較

表1 3組間Cx32蛋白雜交檢測(cè)產(chǎn)物灰度值比較

組別 n Cx32正常肝組織30 0.951±0.06肝炎組織 30 0.750±0.05肝細(xì)胞癌組織 30 0.530±0.10 F 12.362 P 0.000

2.2 RT－PCR結(jié)果 灰度掃描與灰度值結(jié)算結(jié)果分析顯示Cx32mRNA肝細(xì)胞癌組織、肝炎組織及正常肝臟中的表達(dá)含量類(lèi)似，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體情況見(jiàn)圖1與表2。

表2 3組間Cx32蛋白R(shí)T－PCR檢測(cè)產(chǎn)物灰度值比較

表2 3組間Cx32蛋白R(shí)T－PCR檢測(cè)產(chǎn)物灰度值比較

組別 n Cx32／β－actin正常肝組織30 1.15±0.15肝炎組織 30 1.36±0.14肝細(xì)胞癌組織 30 1.24±0.08 F 0.625 P 0.963

圖1 Cx32蛋白R(shí)T－PCR檢測(cè)產(chǎn)物圖

3 討 論

連接蛋白是由連接蛋白基因家族編碼的一組蛋白質(zhì)，它們?cè)诓煌募?xì)胞、組織、器官以及其不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)都有所不同［5］。同一種細(xì)胞也可有表達(dá)幾種不同的連接蛋白，同一組織與器官也可以包含多種連接蛋白，它們是構(gòu)成細(xì)胞間隙連接主要組成成分，廣泛存在于多細(xì)胞動(dòng)物間，是細(xì)胞間隙連接通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［6］。

近年的研究顯示，腫瘤組織中常伴有細(xì)胞間隙連接通訊的異常，主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的同型細(xì)胞間隙連接通訊減少，從而使腫瘤細(xì)胞脫離機(jī)體的調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤無(wú)限增殖［7－8］；另一方面，通過(guò)共同培養(yǎng)、藥物干預(yù)可使連接蛋白表達(dá)得到恢復(fù)，從而可抑制腫瘤生長(zhǎng)［9］。有研究表明Cx基因表達(dá)不僅受到甲基化調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)作用還受到糖皮質(zhì)激素、轉(zhuǎn)錄因子等的影響［10］。而基因異常甲基化是癌變的早期事件，可望通過(guò)藥物干預(yù)恢復(fù)正常甲基化模式，從而達(dá)到防治腫瘤的目的。最新研究顯示胞間隙連接蛋白Cx32、Cx43蛋白表達(dá)明顯受抑，且隨肝細(xì)胞肝癌惡性程度的升高而表達(dá)逐級(jí)遞減，與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cx32mRNA、Cx43mRNA在肝細(xì)胞肝癌組織和正常肝組織中均無(wú)明顯的變化，提示肝癌細(xì)胞Cx32、Cx43基因表達(dá)過(guò)程中轉(zhuǎn)錄正常，而在翻譯或翻譯后蛋白質(zhì)加工、修飾過(guò)程存在異常。Cx43蛋白酪氨酸磷酸化作用，使細(xì)胞間間隙連接通訊功能受到抑制，胞內(nèi)第二信使游離鈣濃度（［Ca2＋］i）的改變是該信使系統(tǒng)反應(yīng)的關(guān)鍵。系統(tǒng)、全面地揭示肝細(xì)胞肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要分子機(jī)制，探討肝細(xì)胞癌早期診斷和判斷預(yù)后的有效指標(biāo)，并開(kāi)辟肝細(xì)胞癌基因治療的新途徑［11］。在前人的Cx32免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)Cx32蛋白在肝細(xì)胞癌組織的表達(dá)低于肝炎組織及正常肝臟中［12］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝癌組織Cx32蛋白雜交產(chǎn)物灰度值顯著低于正常肝組織（P＜0.01），并顯著低于肝炎組織（P＜0.05）。而肝炎組織和正常肝組織中該蛋白無(wú)明顯差異，提示肝細(xì)胞癌中Cx32蛋白表達(dá)的減少可能是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要機(jī)制之一。同時(shí)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Cx32mRNA在肝細(xì)胞癌組織、肝炎組織及正常肝臟中的表達(dá)含量類(lèi)似，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示肝細(xì)胞癌中Cx32蛋白缺失可能是Cx32基因在翻譯或蛋白質(zhì)的加工修飾過(guò)程中異常所致。

總之，Cx32基因作為抑癌基因，在肝癌組織中Cx32蛋白表達(dá)下調(diào)，可能是肝癌組織的重要機(jī)制之一，而Cx32蛋白缺失可能與Cx32基因在轉(zhuǎn)錄后的翻譯或翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾過(guò)程異常相關(guān)。

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