郭素芳，魏瑞霞，張 勇，福 泉，張軍力

2.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市準(zhǔn)格爾旗人民醫(yī)院。

布魯菌是一種動(dòng)物源性人畜共患病病原菌，可引起布魯菌病。臨床表現(xiàn)為多汗、反復(fù)發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、肝脾腫大。人類對(duì)布魯菌普遍易感。布魯菌病以皮膚接觸感染為主［1］，是牧業(yè)人員和某些職業(yè)人群感染布魯菌的主要途徑；其次，飲用生乳和食入污染布魯菌的食物而發(fā)生消化道傳染。臨床布魯菌主要分離自血液，由于此菌臨床分離較少，關(guān)于該菌在Bact／Alert血培養(yǎng)儀上生長曲線特點(diǎn)的研究極少見。本院于2011年4月—2013年1月從15例患者血液中分離出15株布魯菌，通過觀察布魯菌在Bact／Alert血培養(yǎng)儀上生長曲線特點(diǎn)，可幫助我們預(yù)測(cè)該菌株生長，協(xié)助臨床快速診斷布魯菌病。實(shí)驗(yàn)室對(duì)布魯菌病的診斷有重要作用，從發(fā)熱布魯菌病患者的血液中或慢性感染患者的組織（如骨髓）中分離布魯菌是診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)［2］。

材料與方法

一、材料

（一）病例（菌株）來源 2011年4月—2013年1月從15例患者血液中分離出15株布魯菌，血清布魯菌凝集試驗(yàn)均為陽性，診斷為布魯菌病，臨床上均表現(xiàn)有不規(guī)則發(fā)熱和動(dòng)物接觸史。

（一）儀器與試劑 Bact／Alert 3D全自動(dòng)培養(yǎng)儀及廠家配套血培養(yǎng)瓶購自法國生物梅里埃公司。

二、方法

（一）標(biāo)本采集 無菌采集血液10 mL，注入中和抗生素的需氧瓶和厭氧瓶，經(jīng)儀器掃描識(shí)別后，直接放進(jìn)培養(yǎng)儀，培養(yǎng)儀自動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)。

（二）實(shí)驗(yàn)室鑒定 血培養(yǎng)儀需氧瓶陽性報(bào)警，觀察細(xì)菌生長曲線。注射器抽取血培養(yǎng)瓶中的樣本轉(zhuǎn)種到血平皿、巧克力平皿、麥康凱平皿35℃、5%CO2培養(yǎng)，并且進(jìn)行尿素水解試驗(yàn)及涂片。4 h內(nèi)尿素水解試驗(yàn)陽性，有布魯菌生長的可能性極大。涂片可見革蘭染色陰性球桿菌、染色很弱?？率先旧ㄊ氰b別布魯菌很好的方法［3］，布魯菌染成淡紅色，為球桿菌，其他細(xì)菌或細(xì)胞為綠色（或藍(lán)色），對(duì)比明顯。72 h血平皿及巧克力平皿上生長出較小、灰色、圓形、突起、邊緣整齊且不溶血的大小相同的小菌落，麥康凱平皿上無菌落生長。革蘭染色為陰性球桿菌、染色弱、細(xì)沙樣。15 min內(nèi)尿素水解試驗(yàn)陽性，氧化酶、觸酶、硝酸鹽均為陽性，吲哚為陰性。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌 ATCC 27853。2012年6月以前菌株未鑒定到種；6月之后的5株菌經(jīng)VITEKⅡ鑒定為馬爾他布魯菌（Bruc.melitensis 97%），鑒定編碼100000130020100。對(duì)于血液、組織或無菌體液來源的陽性培養(yǎng)物，若該菌在血平皿上的菌落是小菌落、麥康凱平皿上不生長，氧化酶和觸酶為陽性，吲哚試驗(yàn)為陰性，有上述生化反應(yīng)特征，且2 h內(nèi)尿素水解試驗(yàn)為陽性的微生物應(yīng)被推定為布魯菌，并應(yīng)立即采取生物恐怖預(yù)防措施［4］。

結(jié) 果

絕大多數(shù)細(xì)菌是以二分裂方式繁殖，所以可以將生長和繁殖的整個(gè)過程分為遲緩期、對(duì)數(shù)生長期和穩(wěn)定期［5］。繁殖速度快的菌種一般遲緩期較短，繁殖速度慢的菌種一般遲緩期較長。圖1a為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出金葡菌生長曲線，葡萄球菌屬細(xì)菌生長期曲線有一定的傾斜可見遲緩期、對(duì)數(shù)生長期及穩(wěn)定期3個(gè)階段，生長期曲線角度較大；圖1b是本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出布魯菌生長曲線，布魯菌遲緩期曲線較平坦，3 d左右陽性報(bào)警，生長期曲線短，穩(wěn)定期曲線平坦；圖1c是本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出大腸埃希菌生長曲線，腸桿菌科細(xì)菌遲緩期較短，生長期生長迅速，甚至無穩(wěn)定期。

圖1 血培養(yǎng)葡萄球菌、布魯菌、腸桿菌科細(xì)菌生長曲線Figure 1 The characteristic growth curves of Staphylococcus aureus，Brucellaand E.coli in blood culture

討 論

布魯菌的生長曲線不同于腸桿菌科細(xì)菌、葡萄球菌，與不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌生長曲線相同。李新等［6］報(bào)道，不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌在血培養(yǎng)儀上生長曲線的特點(diǎn)是：生長期所對(duì)應(yīng)的縱軸較短，遲緩期和穩(wěn)定期曲線較平坦，陽性報(bào)警時(shí)間均值18.8 h。陳日榮等［7］觀察腸桿菌科細(xì)菌、葡萄球菌、不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌、鏈球菌屬細(xì)菌、腸球菌屬細(xì)菌及真菌的生長曲線，結(jié)果與李新等報(bào)道的相同，陽性報(bào)警時(shí)間均小于24 h。本院分離的15株布魯菌在Bact／Alert 3D血培養(yǎng)儀上的生長曲線與不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌的特點(diǎn)相同，陽性報(bào)警時(shí)間均值63.9 h，只有1株菌在36 h出現(xiàn)生長期，較其他14株菌生長期出現(xiàn)早。由此可見布魯菌的生長曲線特點(diǎn)雖然與不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌相同，但陽性報(bào)警時(shí)間較晚。有研究表明，在布魯菌流行地區(qū)使用血培養(yǎng)儀監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，大部分布魯菌在3 d內(nèi)可獲得陽性結(jié)果［8］。內(nèi)蒙古自治區(qū)是布魯菌病流行地區(qū)，本研究中15株布魯菌均在3 d左右檢出。如出現(xiàn)上述生長曲線時(shí)，應(yīng)高度懷疑為布魯菌，后續(xù)的操作都應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，轉(zhuǎn)種的平皿要延長培養(yǎng)時(shí)間，因大多數(shù)布魯菌在血平皿及巧克力平皿上需要48～72 h以上才能生長出肉眼可見的菌落。注射器抽取血培養(yǎng)瓶中液體直接進(jìn)行尿素水解試驗(yàn)，結(jié)合涂片革蘭染色細(xì)菌形態(tài)特點(diǎn)或柯氏染色可以提示布魯菌生長，比從平皿選取菌落進(jìn)行上述試驗(yàn)提前24～48 h。

用布魯菌診斷血清即可確定布魯菌，但不能鑒定到種。在選用治療藥物時(shí)可根據(jù)鑒定到屬的結(jié)果。鑒定到種和生物型水平有助于流行病學(xué)研究。通常不推薦進(jìn)行布魯菌藥物敏感試驗(yàn)，大多數(shù)布魯菌病治療失敗并非由于細(xì)菌耐藥［9］。

布魯菌侵襲力較強(qiáng)，可以通過黏膜、完整皮膚、呼吸道感染人類，在體內(nèi)有很強(qiáng)的繁殖和擴(kuò)散能力。由于布魯菌對(duì)人有極強(qiáng)的致病力，常可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室獲得性感染，被認(rèn)為是潛在的生物恐怖病原菌，氣溶膠是實(shí)驗(yàn)室獲得性感染的主要原因。實(shí)驗(yàn)室感染可能與未在生物安全柜內(nèi)處理陽性血培養(yǎng)標(biāo)本有關(guān)。國外文獻(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室暴發(fā)感染的相關(guān)報(bào)道［10－11］。我國近年也有實(shí)驗(yàn)室感染布魯菌的相關(guān)報(bào)道［12－13］。因此，必須嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室安全操作規(guī)程，處理感染性材料時(shí)，特別是處理布魯菌等具有高度傳染性的標(biāo)本時(shí)，需要在3級(jí)生物安全防護(hù)下進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)室工作者應(yīng)認(rèn)識(shí)到氣溶膠傳播的危險(xiǎn)，適當(dāng)使用生物安全防護(hù)，降低實(shí)驗(yàn)室獲得性感染的風(fēng)險(xiǎn)。

［1］ 劉錫光.現(xiàn)代診斷微生物學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：530.

［2］ 沈定霞.布魯菌感染的臨床特性及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（1）：8－9.

［3］ 陳東科、孫長貴.實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：80.

［4］ CLSI.Abbreviated Identification and Bacteria and Yeast；Approved Guideline－Second Edition［S］.CLSI document M35－A2.Wayne，PA：Clinical and Labomtory Standards Instiute，2008.

［5］ 張穎悟，藍(lán)宏泰，鄭家齊.臨床微生物學(xué)［M］.大連：大連出版社，1990：21－28.

［6］ 李新，焦連亭，康淑荷，等.細(xì)菌在血培養(yǎng)儀上生長曲線的特點(diǎn)分析［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2003，21（4）：229－232.

［7］ 陳日榮，李惠冰，周美容.不同種類微生物在全自動(dòng)血培養(yǎng)儀中的生長曲線特點(diǎn)及其意義［J］.中國感染控制雜志，2006，5（3）：206－208.

［8］ CLSI.Principles and Procedures for Blood Cultures；Approved Guideline［S］.CLSI document M47A.Wayne，PA：Clinical and Labomtory Standards Instiute，2007.

［9］ 徐建國，梁國棟，邢來君，等主譯.臨床微生物學(xué)手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2005：892.

［10］ Robichaud S，Libman M，Behr M，et al.Prevention of laboratory－acquired brucellosis［J］.Clin Infect Dis，2004，38（12）：e119－e122.

［11］ Fiori PL，Mastrandrea S，Rappelli P，et al.Brucella abortus infection acquired in microbiology laboratories［J］.J Clin Microbiol，2000，38（5）：2005－2006.

［12］ 張海艷，馬立憲，周艷麗.一例實(shí)驗(yàn)室感染布魯氏菌病病例的流行病學(xué)調(diào)查［J］.首都公共衛(wèi)生，2008，2（1）：38－39.

［13］ 王帝，翟璐.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)28名師生因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)感染嚴(yán)重傳染?。跱］.中國青年報(bào)，2011－09－03.