甘衛(wèi)剛，洪育明，劉 海，梁振源

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，四川南充 637000;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，福建泉州362000)

下咽癌作為頭頸部發(fā)病率較低的惡性腫瘤，原發(fā)于下咽黏膜上皮，以鱗狀細(xì)胞癌為主，具有生長部位隱蔽，各種臨床癥狀有出現(xiàn)相對較晚、生長侵襲、轉(zhuǎn)移率較高等特性，臨床診斷較難，發(fā)現(xiàn)較晚，晚期生存率低，生活質(zhì)量差。因而，研究細(xì)胞因子與下咽鱗癌血管發(fā)生、腫瘤生長的相關(guān)性，觀察下咽鱗癌預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)，不僅為下咽鱗癌的早期診斷提供合理的理論依據(jù)，也將在一定程度上為綜合治療提供指導(dǎo)。

近年來，研究［1-2］表明:CD105在多數(shù)實(shí)體腫瘤中如胃癌、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌等異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。另有研究［3-4］表明，VEGF及CD105標(biāo)記的MVD在頭頸部惡性腫瘤，如舌鱗癌、喉鱗癌、食管鱗癌等中異常表達(dá)，提示其與頭頸部惡性腫瘤的生物學(xué)行為具有密切關(guān)系。本研究采用免疫組化PV-9000二步法，檢測下咽鱗狀細(xì)胞癌和正常下咽黏膜中VEGF、CD105標(biāo)記的MVD的表達(dá)，旨在分析它們與下咽鱗癌發(fā)生、發(fā)展、分型、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相互關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組 選擇我院及合作醫(yī)院下咽鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本50例(術(shù)前均未經(jīng)放化療)，標(biāo)本采集時(shí)間起自2000年1月至2012年8月，其中男性47例，女性3例;年齡42～79歲，平均年齡56.8歲;按腫瘤原發(fā)部位可分為:梨狀窩區(qū)26例，下咽后壁區(qū)15例，環(huán)后區(qū)9例;臨床分期參照國際抗癌協(xié)會(UICC，2002)TNM分期標(biāo)準(zhǔn):T1～T220例(其中T14例;T216例);T3～T430例(其中，T322例;T48例);腫瘤組織學(xué)分化程度:低分化癌9例、中分化癌26例、高分化癌15例;頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者7例，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者43例。

1.1.2 對照組 選取下咽癌手術(shù)癌旁組織(距腫瘤切緣2～3 cm)，以及喉癌患者行全喉切除術(shù)的環(huán)后區(qū)或梨狀窩區(qū)黏膜，切取標(biāo)本均為肉眼觀正常，并在HE染色鏡下確認(rèn)未見癌細(xì)胞的下咽正常黏膜組織50例。

1.2 主要試劑

①兔抗人單克隆抗體 VEGF(濃縮型，ZA-0509);②鼠抗人單克隆抗體 CD105(即用型，ZM-0297);③PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒等。以上試劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

按照免疫組化二步法(PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒說明書提示步驟)進(jìn)行免疫組化染色，VEGF、CD105標(biāo)記的MVD均用已知血管肉瘤組織作陽性對照，二者均用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 染色結(jié)果判斷

VEGF的陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，根據(jù)陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)和陽性表達(dá)部位的染色強(qiáng)度兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評分:①以著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的多少進(jìn)行評分，0分:0;l分:≤25%;2分:26% ～49%;3分:≥50%。②按表達(dá)部位染色強(qiáng)度評分，0分:視野中細(xì)胞均無染色;1分:陽性表達(dá)部位染成淺棕色;2分:細(xì)胞陽性表達(dá)部位染成棕色且背景無著色，或細(xì)胞陽性表達(dá)部位染成深棕色并有淺棕色背景;3分:細(xì)胞陽性表達(dá)部位染成深棕色且背景無著色。分別按上述標(biāo)準(zhǔn)，在有經(jīng)驗(yàn)的病理科診斷醫(yī)生指導(dǎo)下采用雙盲法進(jìn)行評分，評分結(jié)果相乘為最終得分:記0分，評分為0分者;記1分，評分為1～2分者;記2分，評分為3～4分者;記3分，評分為6～9分者。陰性，記為0～1分者;陽性，記為2～3分者［5］。

CD105陽性表達(dá)主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，微血管計(jì)數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Weidner等［6］的評判標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算腫瘤著色的毛細(xì)血管和微小血管，凡呈現(xiàn)棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群，并與周圍組織有明顯界限者作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，先用低倍鏡下(×40)選擇5個(gè)MVD最高區(qū)，然后在400倍鏡下計(jì)數(shù)，取5個(gè)視野的微血管數(shù)平均值作為MVD，結(jié)果以(±s)表示。

1.5 圖像分析

先在OLYMPUS BX41光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化切片表達(dá)情況，然后選擇每張切片的4個(gè)角和中央共5個(gè)區(qū)域，在400倍視野下，采用 Motic MED6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)在同一個(gè)光源、亮度、色彩飽和度、增益、對比度及白平衡條件下進(jìn)行拍照，所得圖片應(yīng)用美國Media Cybemetics公司生產(chǎn)的Image-ProPlus圖像分析軟件(Version6.0)(IPP 6.0)進(jìn)行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:①VEGF在實(shí)驗(yàn)組與對照組之間陽性表達(dá)率比較采用Chisquare Test，MVD計(jì)數(shù)在兩組間比較采用t檢驗(yàn);②VEGF圖像分析結(jié)果及MVD計(jì)數(shù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩者與臨床特征之間的關(guān)系采用t檢驗(yàn)，3組之間的比較采用F檢驗(yàn);③VEGF、MVD計(jì)數(shù)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。所有結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 VEGF蛋白在下咽鱗癌及正常下咽黏膜中的表達(dá)情況

VEGF在下咽鱗癌組織及正常下咽黏膜中的表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒(圖1、2)。在50例下咽鱗癌中陽性表達(dá)者37例，表達(dá)率為74.00%(37/50)，而在50例正常下咽黏膜中陽性表達(dá)者15例，占 30.00%(15/50)，兩組間比較 χ2=9.307，P=0.002＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明VEGF在下咽鱗癌中的表達(dá)顯著高于正常下咽黏膜。

2.2 下咽鱗癌組織中VEGF的表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系

下咽鱗癌組織中VEGF的表達(dá)與癌組織的臨床分期、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P＜0.05。即下咽鱗癌組織的T分期越高、組織學(xué)分級程度越低或伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，VEGF呈顯著高表達(dá);不同腫瘤原發(fā)部位、年齡、性別、吸煙史的患者，VEGF表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P＞0.05(表1)。

表1 VEGF蛋白在下咽鱗癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 MVD-CD105在下咽鱗癌及正常下咽黏膜中的表達(dá)情況

CD105蛋白表達(dá)陽性信號主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色粒狀(圖3-5)，利用CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)在下咽鱗癌組織中平均為(37.10±5.95)，而在正常下咽黏膜組織中MVD計(jì)數(shù)平均為(8.70±3.34)，兩組間差異有的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=25.245，P=0.000＜0.05，表明下咽鱗癌組織中MVD計(jì)數(shù)明顯高于正常下咽黏膜組織。

2.4 下咽鱗癌組織中MVD-CD105的表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系

MVD-CD105在下咽鱗癌組織中的表達(dá)與癌組織的臨床分期、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P＜0.05。下咽鱗癌組織中，MVD計(jì)數(shù)在T3～T4組顯著高于T1～T2組，高分化組顯著低于中-低分化組，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，均P＜0.05;不同年齡、性別、吸煙史及不同腫瘤原發(fā)部位的患者中MVD計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05(表2)。

表2 MVD-CD105在下咽鱗癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.5 VEGF和MVD表達(dá)在下咽鱗癌組織中的相互關(guān)系

采用Pearson相關(guān)性分析，對VEGF、MVD兩者在下咽鱗癌組織中的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出:VEGF蛋白表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)呈顯著正相關(guān)，r=0.582，P=0.000 ＜0.05(表3)。

表3 下咽鱗癌組織中VEGF蛋白表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)的相關(guān)性

3 討論

3.1 VEGF在下咽鱗癌中表達(dá)的臨床意義

1989年，F(xiàn)errara等［7］從牛腦垂體濾泡星形細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離并純化一種蛋白質(zhì)，命名為血管內(nèi)皮生長因子。VEGF家族是特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子(不光作用于血管內(nèi)皮)，主要成員包 括:VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，和 VEGF-D。VEGF的受體屬于酪氨酸激酶家族，主要包括三個(gè)成員:VEGF-R1(Flt-1)，R2(Fit-1/KDR)和 R3(Flt-4)。VEGF/VEGF-R2途徑被認(rèn)為參與誘導(dǎo)血管形成，而 VEGF-C/VEGF-R3或 VEGF-D/VEGF-R3途徑則被認(rèn)為參與誘導(dǎo)淋巴管形成。故VEGF-C和VEGF-D又被稱為淋巴管生成因子［8］。VEGF使得血管內(nèi)瘤細(xì)胞能夠輕易穿透血管基底［6］。另外，VEGF可顯著地延長血管內(nèi)皮細(xì)胞的壽命，使血管內(nèi)皮細(xì)胞的繁殖次數(shù)增加15～20次。

Petruzzelli 等［9］使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法對5種不同的頭頸部腫瘤中VEGF的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示均有VEGF的顯著表達(dá)，并且在使用VEGF抗體處理的細(xì)胞株中觀察到內(nèi)皮細(xì)胞的增殖明顯被抑制，表明VEGF與頭頸部腫瘤組織的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)VEGF在下咽鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于下咽正常黏膜，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。結(jié)果與國外學(xué)者分別利用原位雜交［10］、免疫組化方法［11］分析VEGF在頭頸部惡性腫瘤中的表達(dá)情況得出的結(jié)論基本一致，這可能提示VEGF與下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。我們認(rèn)為其可能機(jī)制為VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管支持物的生成，增加血管通透性，為下咽鱗癌生長提供營養(yǎng)基礎(chǔ);同時(shí)，促進(jìn)淋巴管增生，引起腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移，與其預(yù)后不良相關(guān)，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Salven等［12］用免疫組化技術(shù)對頭頸鱗癌患者的VEGF表達(dá)進(jìn)行了研究，并進(jìn)行了5年生存率隨訪，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞質(zhì)中VEGF顯著表達(dá);同時(shí)，血管內(nèi)瘤細(xì)胞能夠輕易穿透血管基底，促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移。VEGF的高表達(dá)也在一些腫瘤滲入的炎性細(xì)胞(包括血細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞)中表現(xiàn)出來。

在本研究中，我們還采用圖像分析系統(tǒng)對下咽鱗癌組織中的VEGF蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)在下咽鱗癌組織T3～T4組顯著高于T1-T2組(t=-2.216，P=0.031 ＜0.05)，組織學(xué)高級分化組顯著低于中-低分化組(t=-2.418，P=0.019＜0.05)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(t=-2.346，P=0.023＜0.05)。同類研究中，Dray等［13］利用免疫組化法對108例原發(fā)頭頸腫瘤病人的VEGF表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)研究，研究發(fā)現(xiàn)VEGF在頭頸鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)經(jīng)常被鄰近組織及炎癥細(xì)胞所介導(dǎo)，故VEGF的表達(dá)在頭頸鱗癌中不作為一個(gè)判斷預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

VEGF除了通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長，介導(dǎo)新生血管生成為下咽鱗癌生長提供營養(yǎng)和氧氣外，更能夠改變新生血管通透性，使得癌細(xì)胞能夠穿過血管基底，進(jìn)入血流，分布到鄰近和遠(yuǎn)處組織，促進(jìn)腫瘤生長浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究證實(shí)，VEGF還可誘導(dǎo)新生淋巴管形成，介導(dǎo)癌細(xì)胞進(jìn)入淋巴循環(huán)，導(dǎo)致淋巴轉(zhuǎn)移，在下咽鱗癌中常見為頸部淋巴轉(zhuǎn)移。

3.2 MVD-CD105在下咽鱗癌中表達(dá)的臨床意義

MVD是通過采用血管標(biāo)記因子，如CD31、CD34、CD105、vWF及Ⅷ因子等檢測腫瘤組織中新生血管的數(shù)量、形態(tài)及分布的指標(biāo)，可以量化腫瘤組織中血管生長速度，反應(yīng)腫瘤組織接受氧供和營養(yǎng)支持的程度，在較多研究中，學(xué)者們?nèi)砸訡D34作為標(biāo)記物，研究結(jié)果多可反應(yīng)血管生成情況［14］。然而，近年來，CD105被發(fā)現(xiàn)是目前腫瘤組織中標(biāo)記未成熟血管的最特異指標(biāo)，更能精確地反應(yīng)腫瘤微血管密度值。

Wikstrom 等［15］發(fā)現(xiàn):CD105主要在未成熟的血管上表達(dá)。Saad等［16］研究證實(shí)，CD105比 CD34和vWF更好作為腫瘤血管標(biāo)志物及預(yù)測腫瘤預(yù)后，CD105可作為一種標(biāo)記新生血管生成的較理想的標(biāo)志物。

另外，CD105可作為一氧化氮的調(diào)節(jié)因子，在小鼠股動脈中，CD105的表達(dá)水平調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的數(shù)量。在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，CD105表達(dá)的強(qiáng)弱相應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶明顯的上升或下降。因此，CD105與血管的發(fā)生、生成及血管壁完整性維護(hù)有關(guān)。因CD105受低氧條件和TGF-β1的共同作用誘導(dǎo)表達(dá)，而腫瘤組織，尤其是惡性腫瘤，在早期階段生長迅速，需要充足的氧氣和營養(yǎng)支持，而正常的血管發(fā)生和形成速度難以滿足其需求，經(jīng)上述調(diào)解模式，此時(shí)便出現(xiàn)CD105在活性血管生成區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，這也就解釋了為什么大血管及正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD105呈表達(dá)顯著下降或呈陰性表達(dá)［17］。

顧欣等［18］研究發(fā)現(xiàn)，CD105標(biāo)記的MVD在喉鱗狀細(xì)胞癌高分化組和低分化組的差別有顯著意義，隨腫瘤浸潤范圍的增大而增加，且隨臨床分期升高而增加。Schimming等［19］發(fā)現(xiàn) CD105標(biāo)記口腔鱗狀細(xì)胞癌微血管密度值明顯高于鄰近的正常黏膜;并且與腫瘤的增殖、分期、轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Akagi等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)、直腸腺瘤由輕度、重度不典型增生至腺癌發(fā)展的過程中，CD105標(biāo)記的微血管密度值逐漸升高，提示CD105有助于早期診斷。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CD105標(biāo)記的MVD與下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的性別、年齡、吸煙史及腫瘤原發(fā)部位之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。而MVD計(jì)數(shù)在下咽鱗癌組織T3～T4組顯著高于T1～T2組，組織學(xué)高級分化組顯著低于中-低分化組，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，與 Chien等［21］學(xué)者對舌鱗癌組織的研究結(jié)果相一致，故可認(rèn)為CD105標(biāo)記的MVD與下咽鱗癌的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其檢測結(jié)果有助于我們對下咽鱗癌的早期認(rèn)識及對病情、預(yù)后等的綜合判斷。

腫瘤組織中的新生血管在形態(tài)學(xué)、數(shù)量變化和分布規(guī)律方面反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)行為變化，根據(jù)MVD表達(dá)與下咽鱗癌的臨床進(jìn)展一致，我們認(rèn)為下咽鱗癌中微血管密度與病情發(fā)展程度密切相關(guān)，在一定意義上可以量化腫瘤新生血管，從而推測MVD可以作為下咽鱗狀細(xì)胞癌病情評估的量化指標(biāo)。CD105是目前腫瘤新生血管的良好標(biāo)志物，主要表達(dá)于未成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，可顯示出單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞和較小的微血管，即體現(xiàn)出腫瘤發(fā)生和初步形成階段，腫瘤血管的數(shù)量變化。

本研究還發(fā)現(xiàn)，下咽鱗癌組織中，CD105標(biāo)記的微血管分布主要呈現(xiàn)兩種趨勢，即在中-低分化組，微血管主要分布于癌組織間(圖3A);而在高分化組中，微血管則可見分布于癌巢內(nèi)，也可見分布于癌間質(zhì)區(qū)(圖3B)，這種分布紊亂可能在一定程度上利于腫瘤細(xì)胞遷徙入血管，加速腫瘤生長、增強(qiáng)侵襲潛能。對于組織學(xué)分化不同的下咽鱗癌組織中，微血管分布的差異性，未在此次實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行詳細(xì)闡述，但可在以后的研究工作中，進(jìn)一步觀察導(dǎo)致上述現(xiàn)象出現(xiàn)的具體機(jī)制。

3.3 下咽鱗癌中VEGF表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)的相互關(guān)系

VEGF在腫瘤血管形成中的重要作用已得到證實(shí)，MVD計(jì)數(shù)則為評估腫瘤血管生成提供客觀依據(jù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF與MVD-CD105在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)均顯著升高，兩者具有正相關(guān)性。這一結(jié)果提示VEGF蛋白的過度表達(dá)與腫瘤MVD計(jì)數(shù)升高密切相關(guān)，可以認(rèn)為VEGF蛋白促進(jìn)下咽鱗狀細(xì)胞癌的新生血管生成，并促進(jìn)下咽鱗狀細(xì)胞癌組織的增殖與轉(zhuǎn)移，與MVD計(jì)數(shù)的變化一致，并與不良預(yù)后密切相關(guān)。

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