張海暉，段玉清，秦 宇，閆永勝，孫曉波

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯 ［(－)-epigallocatechin gallate，簡(jiǎn)稱EGCG］是茶的主要活性成分，具有清除自由基、抗氧化［1－3］、抗癌和防輻射［4－6］等多種生物活性，但兒茶素單體間的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)極其相似，現(xiàn)有吸附劑選擇性吸附能力差，高純度EGCG的分離一直難以實(shí)現(xiàn).因此開發(fā)新型吸附劑、拓展其應(yīng)用范圍、提高吸附劑的選擇性，是解決EGCG分離提取中長(zhǎng)期困擾的高成本、低收率技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵.分子印跡聚合物(molecular imprinted polymers，簡(jiǎn)稱MIPs)是基于分子印跡技術(shù)制備的空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與印跡分子完全匹配的新型聚合物吸附材料，因MIPs對(duì)印跡分子具有高選擇性和識(shí)別性，已在色譜分離、手性拆分、固相萃取、仿生傳感器［6－11］等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景.

鑒于此，文中以EGCG為模板分子，微米硅膠為載體，γ－氨丙基三乙氧基硅烷(KH－550)為功能單體，正硅酸四乙酯(TEOS)為偶聯(lián)劑，采用表面分子印跡技術(shù)，通過(guò)熱聚合方法制備EGCG－微米硅膠分子印跡聚合物，并通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)其進(jìn)行物理表征.通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)固相萃取考察MIPs的性能，為MIPs－固相萃取分離/富集EGCG提供可靠的參考.

1 試驗(yàn)

1.1 硅膠活化

稱取 50.0 g微米(160目)硅膠于 200 mL的3 mol·L－1鹽酸中，攪拌均勻后置于室溫下過(guò)夜后，分別用水和無(wú)水乙醇洗滌抽濾，于120℃下干燥12 h，置于干燥器中備用.

1.2 EGCG分子印跡聚合物的制備

向10 mL具塞試管中加入5 mL氯仿－甲醇(體積比4∶1)和0.04 g EGCG，超聲溶解后，加入1 mL KH－550，磁力攪拌30 min，隨后加入0.5 g微米硅膠和1 mL TEOS，繼續(xù)攪拌20 min，最后加入1.0 mol·L－1醋酸 1 mL，攪拌均勻，充氮?dú)?15 min后，密封.將該混合體系于60℃下攪拌反應(yīng)10 h，反應(yīng)結(jié)束后用無(wú)水乙醇洗滌，置100℃下干燥8 h，得到EGCG分子印跡功能材料前驅(qū)體.將該前驅(qū)體用甲醇－乙酸(體積比9∶1)的混合液索氏提取48 h，以除去印跡分子EGCG，再分別用氯仿和無(wú)水甲醇洗去材料表面的殘留物并將其置于80℃下干燥12 h，即得MIPs.非印跡材料(NIPs)的制備除了不加EGCG外，其余步驟同MIPs.

1.3 MIPs吸附條件篩選

稱取20 mg聚合物分別加入10 mL離心管中，隨后加入質(zhì)量濃度為20 μg·mL－1EGCG不同溶劑的溶液5 mL，充分混合后，于不同溫度水浴中振蕩吸附10 h后，5000 g離心10 min，移取上層清液，于274 nm處測(cè)定吸光度，換算成EGCG的質(zhì)量濃度，差減法計(jì)算吸附量:

式中:Q為聚合物對(duì)EGCG的吸附量，mg·g－1;C0為溶液中EGCG的初始質(zhì)量濃度，μg·mL－1;Ct為溶液中EGCG的終質(zhì)量濃度，μg·mL－1;V為溶液的體積，mL;W為聚合物的質(zhì)量，mg.

1.4 聚合物的靜態(tài)等溫吸附

稱取20 mg的聚合物分別置于10 mL的離心管中，隨后加入pH 5的不同質(zhì)量濃度的EGCG去離子水溶液5 mL，充分混合后，置于25℃恒溫水浴中振蕩吸附10 h，離心取上清于274 nm處測(cè)定吸光度.采用Scatchard模型評(píng)價(jià)MIPs對(duì)EGCG的結(jié)合特性、其公式為

式中:Q和 Ce分別為 MIPs在不同質(zhì)量濃度的EGCG溶液中的吸附量，mg·g－1和終濃度，μg·mL－1;Qmax表示 MIPs的最大吸附量，mg·g－1;kd為平衡解離常數(shù)，μg·mL－1.

1.5 吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

稱取40 mg聚合物于10 mL離心管中，隨后加50 μg·mL－1pH 5 的 EGCG 去離子水溶液5 mL，充分混合后，置于25℃恒溫水浴中振蕩吸附不同時(shí)間，離心取上清液于274 nm處測(cè)定吸光度.分別運(yùn)用準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型描述MIPs對(duì)EGCG的吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程.2個(gè)方程分別為

式中:Qe為平衡狀態(tài)時(shí)MIPs的吸附量，mg·g－1;Qt為t時(shí)刻MIPs的吸附量，mg·g－1;k1為準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)，h－1;k2為準(zhǔn)二級(jí)速率常數(shù)，g·(mg·h－1)－1.

1.6 分子印跡－固相萃取與HPLC選擇性

取50 mg聚合物于5 mL去離子水中充分溶脹之后，裝入固相萃取柱(13 mm×6 mm)，以0.5 mL·min－1的流速加入5 mL蒸餾水清洗并平衡萃取柱，柱床體積(BV)為160 μL.以0.5柱床體積每分鐘的流速上樣，上樣液為EGCG及其相似物，其質(zhì)量濃度均是200 μg·mL－1的pH為5.0去離子水混合溶液，上樣量為1柱床體積，靜置吸附30 min后，用去離子淋洗液，每次1柱床體積共10次，再以甲醇－乙酸(體積比9∶1)洗脫，每次1柱床體積共10次.分別收集淋洗液和洗脫液，氮?dú)獯蹈珊笤儆萌ルx子水定容到原體積，0.45 μm過(guò)濾膜后，HPLC分析檢測(cè).HPLC色譜條件為 ZORBAX 300SB－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色譜柱，甲醇 － 水 － 乙酸(體積比為24.5∶75.0∶0.5)為流動(dòng)相，流速為0.6 mL·min－1，進(jìn)樣量為 10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm.

圖1 活化硅膠，MIPs和NIPs電鏡圖

為定量研究MIPs的選擇性，引入分配系數(shù)Kd，選擇性系數(shù)k和相對(duì)選擇性系數(shù)k'.其中，Kd是分配系數(shù)，定義為平衡狀態(tài)下該溶質(zhì)在兩相中的質(zhì)量濃度之比.k是選擇性系數(shù)，表示同一種吸附劑吸附2種不同物質(zhì)，定義為2種競(jìng)爭(zhēng)性溶質(zhì)的Kd值之比.k'是相對(duì)選擇性系數(shù)，為2種吸附劑的k值之比.計(jì)算公式分別為Kd=Qe/Ce，k=KdEGCG/Kdanalogues和 k'=kMIPs/kNIPs.其中 Ce為達(dá)到平衡時(shí)溶液中EGCG的質(zhì)量濃度，μg·mL－1;Qe為結(jié)合位點(diǎn)的平衡結(jié)合吸附量，mg·g－1.

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物的表征

活化硅膠表面平整且光滑，MIPs的表面明顯出現(xiàn)很多的“空洞”且其表面的凸凹不平的程度明顯比NIPs要深，如圖1所示.

這可能是由于MIPs經(jīng)洗脫后，EGCG分子被洗脫下來(lái)，留下了具有空間結(jié)構(gòu)的“空穴”.聚合物的FT－IR見(jiàn)圖2.

圖2 活化硅膠、NIPs和MIPs的FT－IR

MIPs和NIPs在2937.15 cm－1處是—CH2反對(duì)稱伸縮，1559.52 cm－1處是—NH2變形振動(dòng)吸收峰，1035.36 cm－1處是—C—O的伸縮振動(dòng)的寬吸收峰，這兩處的特征吸收說(shuō)明KH－550和TEOS在NIFMs中聚合成功.

元素分析表明，各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)活化硅膠中C為1.05%，H為0.48%;NIPs中 N為2.09%，C為12.21%，H為3.06%;MIFMs中N為1.12%，C為9.55%，H為3.06%.印跡后，3種元素的含量增加主要來(lái)源于KH－550和TEOS.MIPs中3種特征元素的含量均小于NIFMs，其中碳元素的差距最大，可能是MIPs在印跡過(guò)程中EGCG分子接枝在硅膠表面，進(jìn)而被TEOS所包裹，經(jīng)洗脫后，EGCG分子被洗脫下來(lái)在聚合物表面形成“空穴”.

2.2 吸附條件對(duì)聚合物吸附量的影響

吸附條件對(duì)吸附量的影響如圖3所示.圖3a為吸附溶劑對(duì)聚合物吸附量的影響.在相同溶劑的條件下，MIPs對(duì)EGCG的吸附量均大于NIPs，而且在去離子水中MIPs對(duì)EGCG的吸附量最大，故吸附溶劑選去離子水.圖3b是pH對(duì)MIPs吸附量的影響.當(dāng)pH 3～5時(shí)吸附量逐漸增加，pH為5時(shí)MIPs的吸附量達(dá)到最大值，隨著pH值的升高反下降，因?yàn)镋GCG在pH 5時(shí)以分子形式存在，能與功能單體充分作用，故吸附溶劑最佳pH為5.圖3c為溫度對(duì)MIPs吸附EGCG的影響.當(dāng)溫度在15～25℃時(shí)吸附量逐漸增 加，且25℃時(shí)吸附量達(dá)到最大，故最佳溫度選25℃.

圖3 吸附條件對(duì)吸附量的影響

2.3 等溫吸附模型

聚合物對(duì)EGCG的等溫吸附結(jié)果如圖4所示.

圖4 聚合物對(duì)EGCG的等溫吸附

在低質(zhì)量濃度時(shí)，聚合物的吸附量與EGCG的質(zhì)量濃度呈正相關(guān).隨EGCG質(zhì)量濃度的增加，MIPs結(jié)構(gòu)中的空間位點(diǎn)被充分“占據(jù)”.而在NIPs表面不存在有效的空間位點(diǎn)，與EGCG是非特異性作用力結(jié)合，故 MIPs的吸附量高于 NIPs(圖4a).當(dāng)EGCG 質(zhì)量濃度為 50 μg·mL－1時(shí)，MIPs的吸附量是NIPs的2.8倍.依據(jù)Scatchard模型，以Q/Ce為縱坐標(biāo)，Q為橫坐標(biāo)得擬合方程為Q/Ce=32.529－2.0359Q，相關(guān)系數(shù)R2=0.9912(圖4b)，表明MIPs對(duì)EGCG的吸附過(guò)程符合Scatchard模型.方程的斜率和截距分別表示Kd和Qmax.從方程可計(jì)算出MIPs對(duì) EGCG 的 Qmax為15.98 mg·g－1，Kd為0.49.

2.4 聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)特性

聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)特性見(jiàn)圖5.

圖5 聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)特性

由圖5a所示，MIPs對(duì)EGCG的吸附在4 h時(shí)幾乎達(dá)到吸附平衡;4 h后，吸附量增加緩慢.圖5b是10 h內(nèi)ln(C0/Ct)和t的相關(guān)動(dòng)力學(xué)曲線.第1部分直線表明，0～4 h內(nèi)MIPs對(duì)EGCG的快速吸附特性;第2部分直線表現(xiàn)出低的吸附速率，基本趨于平穩(wěn)(4～10 h).表明MIPs在起始階段對(duì)EGCG的吸附能力較強(qiáng)，待MIPs表面的空間位點(diǎn)充分吸附以后(達(dá)到飽和位點(diǎn))曲線呈現(xiàn)平緩的趨勢(shì)，吸附接近平衡.

MIPs對(duì)EGCG的吸附動(dòng)力學(xué)準(zhǔn)一級(jí)速率線性公式為ln(Qe－Qt)= －0.5296t+1.5046，R2=0.9971，k1為0.53 h－1;準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)速率公式為t/Qt=0.1461t+0.1194，R2=0.9928，k2為0.19 g·(mg·h－1)－1.表明 MIPs對(duì) EGCG 的吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程更加符合準(zhǔn)一級(jí)速率方程.

2.5 MIPs對(duì)EGCG和其類似物的選擇性

MIPs對(duì)EGCG和其類似物的選擇性見(jiàn)表1.

表1 MIPs對(duì)EGCG和其類似物的選擇性

由表1可見(jiàn)MIPs對(duì)EGCG的Kd(25.24)均高于其他類似物，分別是EGC，C，EC，GCG和ECG的13，26，12，9 和 11 倍，說(shuō)明 MIPs對(duì) EGCG 分子具有優(yōu)先吸附的特性，這與MIPs表面的空間位點(diǎn)有關(guān);通過(guò)比較k值可以得出，k值越大，吸附劑的吸附能力越好，MIPs對(duì)其類似物的 k值分別是 EGC(13.79)，C(26.29)，EC(12.94)，GCG(9.08)和ECG(11.74)，即表示MIPs對(duì)EGCG的分離系數(shù)是其類似物的k倍，也說(shuō)明MIPs對(duì)EGCG的吸附能力遠(yuǎn)高于其類似物.通過(guò)比較k'值可得出MIPs相對(duì)于NIPs的選擇性大小，由表可見(jiàn)，k'值均大于1，說(shuō)明MIPs相對(duì)于NIPs具有良好的選擇性，而且MIPs對(duì)EGCG結(jié)構(gòu)類似物的選擇性大小的順序?yàn)镃，EGC，EC，ECG，GCG.通過(guò)制備的EGCG分子印跡聚合物MIPs能實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中EGCG的分離與富集.

3 結(jié)論

1)在相同溶劑的條件下，MIPs對(duì)EGCG的吸附量均大于NIPs，而且在去離子水中MIPs對(duì)EGCG的吸附量最大.

2)在低質(zhì)量濃度時(shí)，聚合物的吸附量與EGCG的質(zhì)量濃度呈正相關(guān).MIPs對(duì)EGCG的吸附過(guò)程符合Scatchard模型.

3)MIPs對(duì)EGCG的吸附在4 h時(shí)可達(dá)到吸附平衡，MIPs對(duì)EGCG的吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程更加符合準(zhǔn)一級(jí)速率方程.

4)MIPs對(duì)EGCG的選擇性系數(shù)Kd分別是其結(jié)構(gòu)類似物 EGC，C，EC，GCG 和 ECG 的 13，26，12，9和11倍，表明MIPs對(duì)EGCG分子具有優(yōu)先吸附的特性，其選擇性大小的順序?yàn)镃，EGC，EC，ECG，GCG.

5)試驗(yàn)證明，制備的EGCG分子印跡聚合物MIPs吸附速度快，吸附效率高，能用于實(shí)際樣品中EGCG的分離與富集.

References)

［1］Horie N，Hirabayashi N，Takahashi Y，et al.Synergistic effect of green tea catechins on cell growth and apoptosis induction in gastric carcinoma cells［J］.Biological＆ Pharmaceutical Bulletin，2005，28(4):574－579.

［2］Osada K，Takahashi M，Hoshina S，et al.Tea catechins inhibit cholesterol oxidation accompanying oxidation of low density lipoprotein in vitro［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part C，2001，128(2):153－164.

［3］Saffari Y，Sadrzadeh S M.Green tea metabolite EGCG protects membranes against oxidative damage in vitro［J］.Life Sciences，2004，74(12):1513 －1518.

［4］Hernaez J F，Xu M，Dashwood R H.Antimutagenic activity of tea towards 2-hydroxyamino-3-methylimidazo［4，5-f］quinoline:effect of tea concentration and brew time on electrophile scavenging ［J］.Mutation Research，1998，402(1/2):299－306.

［5］Sen T，Moulik S，Dutta A，et al.Multifunctional effect of epigallocatechin-3-gallate(EGCG)in downregulation of gelatinase-A(MMP-2)in human breast cancer cell line MCF-7［J］.Life Sciences，2009，84(7/8):194 －204.

［6］Elmets C A，Singh D，Tubesing K，et al.Cutaneous photoprotection from ultraviolet injury by green tea polyphenols［J］.Journal of the American Academy of Dermatology，2001，44:425－432.

［7］賀敏強(qiáng)，宋承成，陳永強(qiáng)，等.芹菜素分子印跡聚合物的分子識(shí)別性能及機(jī)理［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，31(5):596－600.He Minqiang，Song Chengcheng，Cheng Yongqiang，et al.Recognition property and mechanism of molecularly imprinted polymers of apigenin［J］.Journal of Jiangsu University:Natural Science Edition，2010，31(5):596 －600.(in Chinese)

［8］史瑞雪，郭成海，鄒小紅，等.分子印跡技術(shù)研究進(jìn)展［J］.化學(xué)進(jìn)展，2002，14(3):182－191.Shi Ruixue，Guo Chenghai，Zou Xiaohong，et al.The development of research in molecular imprinting technique［J］.Progress in Chemistry，2002，14(3):182 －191.(in Chinese)

［9］孫瑞豐，羅 暉，隋洪艷，等.計(jì)量置換模型在分子印跡聚合物色譜分離中的應(yīng)用［J］.過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2003，3(2):165 －170.Sun Ruifeng，Luo Hui，Sui Hongyan，et al.Application of stoichiometric displacement model for retention to the chromatographic separation by molecular imprinting polymer［J］.The Chinese Journal Process Engineering，2003，3(2):165 －170.(in Chinese)

［10］吳 云，戈延茹，潘 如，等.SBA－15表面咖啡因分子印跡聚合物的制備及性能研究［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，(22)2:151－154.Wu Yun，Ge Yanru，Pan Ru，et al.Preparation and characterization of mesoporous silica SBA－15-supported molecularly caffeine-imprinted polymers by surface molecularly imprinting technique［J］.Journal of Jiangsu University:Medicine Edition，2012，(22)2:151 －154.(in Chinese)

［11］Carboni D，F(xiàn)lavin K，Servant A，et al.The first example of molecularly imprinted nanogels with aldolase type I activity［J］.Chemistry-A European Journal，2008，14(23):7059－7065.