賀萌萌，徐猛，杜艷麗，顏增光，* ，王林權(quán)，周友亞，郭觀林，侯紅，李發(fā)生

1．西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院，楊凌712100

2．中國環(huán)境科學研究院環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京100012

3．北京農(nóng)學院植物科學技術學院，北京102206

土壤重金屬污染是近年來國內(nèi)外普遍關注的環(huán)境問題，最受矚目的污染物包括汞(Hg)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr)和類金屬砷(As)等，其中鎘因其移動性強、毒性大、污染范圍廣、檢出頻率高而被美國有毒物質(zhì)與疾病登記署列為超級基金場地優(yōu)先污染物(Priority List of Hazardous Substances)中的第7大有害物質(zhì)(http://www．a(chǎn)tsdr．cdc．gov/SPL/index．html)。土壤中鎘的來源除母質(zhì)母巖風化、火山噴發(fā)等自然源釋放外，與人類活動相關的污染源主要有大氣沉降、工業(yè)(如電池生產(chǎn))廢物排放、礦山資源開發(fā)、交通污染以及污泥和化肥(尤其是磷肥)應用等［1］。鎘進入土壤后，可通過溶解、沉淀、凝聚、絡合、吸附和解吸等行為與土壤組分發(fā)生相互作用［2］，并可通過植物根系吸收在植物體內(nèi)發(fā)生積累，達到一定程度時會對植物產(chǎn)生一系列的毒害效應，如引起水分和養(yǎng)分失衡、激素失調(diào)、氣孔導度下降和氣體交換能力減弱、蒸騰和光合作用降低、細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷、相關酶系(如ATP酶)和色素(如葉綠素)的生物合成與生理功能受損、氮固定與碳同化能力下降等，從而導致植物生長遲緩、葉片失綠、壞死或卷葉、植物根系受損、植株矮化和生物量下降，嚴重時甚至可導致全株死亡［3-5］。此外，土壤中的鎘還可以通過孔隙水接觸暴露等途徑，對土壤動物(如蚯蚓、跳蟲、線蟲等)和微生物產(chǎn)生毒害效應［6］，如引起土壤動物生殖量下降［7］，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化及土壤功能部分或全部喪失［8］，從而對土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全與穩(wěn)定構(gòu)成威脅。

已有研究表明，鎘對植物生長的早期生命階段有很強的毒性，如可抑制種子發(fā)芽、阻礙幼苗生長、延緩根系發(fā)育，以及誘導植物產(chǎn)生生理生化異常或病理變化等。目前，水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、大豆、豌豆、綠豆、辣椒、煙草和向日葵等植物幼苗已被廣泛用于研究土壤中鎘的生物富集特性及生態(tài)毒理效應［5］。近年來，我國對鎘污染土壤的生態(tài)毒理研究也日益重視和關注，但出于保護人體健康和食品安全等考慮，現(xiàn)有的研究多集中于作物產(chǎn)量對鎘脅迫的響應及鎘在植物體內(nèi)的累積富集特性等方面［9-14］，或是偏重于從機制上解釋鎘對植物結(jié)構(gòu)與組分(如葉綠體和葉綠素)、生理過程(如氧化脅迫反應)以及生化指標(如抗氧化酶活性)的影響［15］，而從生態(tài)毒理效應角度考慮鎘對植物苗期生長和根系發(fā)育的毒理學研究還相對偏少［16］，從保護土壤功能方面探討鎘對植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響也只略有涉及［17-18］，相關的毒理效應指標和濃度閾值還有待建立。本文研究了鎘在北京褐潮土中對玉米幼苗及其根際微生物的毒害效應，探討了鎘在玉米幼苗根、莖、葉中的累積富集特性，明確了鎘影響玉米幼苗生長和發(fā)育(以生物量、株高等作為代表性測試終點)的效應濃度閾值，研究結(jié)果可為鎘污染土壤的生態(tài)風險評估和我國土壤環(huán)境質(zhì)量標準的制/修訂提供基礎參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 試劑和材料

氯化鎘(CdCl2·5/2H2O)購自國藥集團化學試劑有限公司，純度＞98%。實驗所用玉米品種為鄭單958，購自中國農(nóng)業(yè)科學院，選取顆粒飽滿，大小均一的玉米種子用于實驗。供試土壤為采自中國環(huán)境科學研究院梨園的表層(0～20 cm)土壤，土壤在使用前先于溫室內(nèi)自然風干，剔除植物根系，然后過2 mm篩除去大的礫石土塊。實驗土壤的干容重為2．96 kg·dm-3，pH 值7．28，有機質(zhì)含量1．13%(質(zhì)量百分比)，陽離子交換量7．2 cmol·kg-1，最大持水量 29．3%(質(zhì)量百分比)，黏粒、粉粒和砂粒含量分別為11．63%、15．12%和73．25%(體積百分比)。實驗土壤中典型重金屬砷、汞、銅、鎘、鉻、鋅、鎳和鉛的本底濃度分別為 7．3、0．09、19．0、0．30、56．5、78．5、32．6 和26．0mg·kg-1。

1．2 玉米盆栽實驗

在預實驗確定毒性范圍的基礎上，選擇10、22、46、100、220、460 和1 000 mg·kg-1等 7 個成幾何等差系列的鎘濃度進行實驗，以不添加鎘的土壤為對照(CK)。詳細操作過程為:先將適量氯化鎘溶于200 mL去離子水配成系列濃度的氯化鎘水溶液，加入到2 kg干燥土壤中，充分混勻后，再用去離子水將土壤濕度調(diào)節(jié)至其含水量的20%，然后將土壤裝到塑料花盆中(直徑210 mm，高240 mm)，室溫下放置、平衡7 d后用于實驗。實驗開始前先將玉米種子用去離子水浸泡12 h，至種子吸脹后挑選個大、飽滿的顆粒，按每盆10粒播種(約2 cm深)于實驗土壤中，移入溫室，自然光照，溫度22℃ ～28℃，濕度60%的條件下培養(yǎng)，并根據(jù)需要每天澆1/2 Hoagland營養(yǎng)液［19］1～2次，以保持水分相對平衡(通過稱取質(zhì)量來輔助判斷)。待種子出苗后5 d，疏苗，每盆保留長勢均勻的幼苗4株。在實驗的第28天，檢查并記錄玉米株高、地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等指標，并利用抖土法收集根際土壤用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。玉米根和地上部干質(zhì)量的測定方法是，先將鮮樣在90℃烘箱中烘烤30 min，然后降溫至60℃烘48 h至恒重，稱取質(zhì)量。每個測試濃度重復4次。

1．3 玉米根際微生物群落結(jié)構(gòu)DGGE分析

盆栽實驗結(jié)束時(第28天)，用抖土法采集玉米根際土壤，用MO BIO PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤基因組DNA。將純化所得總DNA進行稀釋后，選用 357F-GC(GC-clamp-5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，其中 GC-clamp序列為5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG-3’)和517R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)擴增 16S rDNA V3區(qū)域，擴增的片段長度為180 bp左右。PCR反應體系為50 μL:10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物(10 μmol·L-1)各1 μL、模板DNA 40 ～50 ng、Takara Ex Taq DNA Polymerase(Takara，大連)1．5U、滅菌高純水補齊至50μL。PCR擴增反應條件為:94℃預變性5 min，94℃變性1min，48℃退火1 min，72℃延伸 1 min，共進行30個循環(huán)，72℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃縮后，加入到10%(m/V)聚丙烯酰胺凝膠中，凝膠的變性范圍為40% ～65%。利用Bio-Rad公司的Dcode System電泳儀，在60℃，85 V，采用1×TAE Buffer電泳16 h。電泳結(jié)束后，使用1∶10 000 sybre green染色15min，使用Bio-Rad Gel Doc XR成像并進行條帶判讀，以配套軟件Quantity One進行遷移率、強度、面積計算，選擇Jaccard指數(shù)計算各樣品間的相似性指數(shù)，其計算公式為:

式中，Cj為Jaccard指數(shù)，j為2個樣品共有物種數(shù)，a、b分別為2個樣品各自物種數(shù)。

采用QIAquick試劑盒對DGGE膠進行割膠回收，以357F/517R為引物進行PCR擴增并測序，將所得序列結(jié)果通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，通過16S rDNA獲得菌株的初步生物學信息。

1．4 樣品測試

土壤中鎘殘留濃度的測定過程為:在實驗的第28天，從每個盆中取土樣約20 g(濕質(zhì)量)，風干、研磨并過100 目篩，取0．2 g在9mL HNO3、HCl和 HF(體積比5∶2∶2)混合消解液中，用微波消解儀(MARS，美國CEM公司)消解。消解過程首先升溫至120℃，保持2 min，然后再升溫至160℃，保持10 min，最后將溫度升至180℃，保持20 min。消解完成后，將消解液轉(zhuǎn)移至消煮管中，加1 mL HClO4，在電熱板上150℃趕酸至1mL，冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，用質(zhì)量分數(shù)為1%的HNO3定容，過濾，然后用ICP-MS(7500，美國Agilent公司)測定鎘的濃度。測試過程中，同時測定空白和標準土壤樣品(中國計量科學研究院土壤成分分析標準物質(zhì)(GBW07410)進行質(zhì)量控制。

玉米組織(根、莖、葉)中鎘累積濃度的測定過程為:將收獲的玉米苗先用自來水洗滌，去除植株表面和根部粘附的土壤，再用去離子水洗涮2～3次，然后用剪刀把玉米苗分解為根、莖、葉 3部分，在90℃烘箱中烘30 min，降溫至60℃烘48 h至恒重。干燥樣品用剪刀剪碎，取0．2 g在6 mL HNO3和H2O2混合消解液(體積比5∶1)中，用電熱板150℃消解2 h，然后趕酸至1 mL，冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，用質(zhì)量分數(shù)為1%的HNO3定容，過濾，ICP-MS測定鎘濃度。測試過程中，同時測定空白和標準植物樣品(中國計量科學研究院生物成分分析標準物質(zhì)綠茶(GBW10052)進行質(zhì)量控制。

1．5 統(tǒng)計分析

利用Logistic回歸方程進行曲線擬合并計算鎘引起玉米幼苗株高、根部和地上部生物量下降10%、20%和50%的效應濃度值(即 EC10、EC20和EC50)。回歸分析采用SYSTAT 11．0統(tǒng)計分析軟件完成，用SigmaPlot 12．0軟件作圖。鎘在玉米組織中的生物富集系數(shù)(BAF)用下式進行計算:

式中，BAF是生物富集系數(shù)，Ct是玉米組織中鎘濃度，Cs是土壤中鎘濃度。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2．1 鎘對玉米幼苗的毒性

在所測定的鎘污染濃度范圍內(nèi)，鎘并不影響玉米的正常萌芽與出苗，所有實驗濃度下種子的出苗率均達到了100%，證明玉米種子發(fā)芽率的確不是測定鎘污染土壤毒性效應的敏感指標［16］。第28天時觀測發(fā)現(xiàn)，高濃度(如100 mg·kg-1及以上)鎘污染土壤中玉米幼苗的生長與發(fā)育受到明顯的抑制，出現(xiàn)植株矮化，植物葉片失綠、卷葉、燒尖或斑點型病變等癥狀(圖1)，但沒有出現(xiàn)幼苗死亡的現(xiàn)象。外源鎘抑制玉米幼苗生長及誘導葉片發(fā)生病變等影響在其他研究中已有報導，如在不同類型的水稻土中，當添加鎘濃度大于5 mg·kg-1時，玉米葉片會出現(xiàn)不同程度的失綠，株高和生物量也較對照顯著降低［20］。植株矮化是鎘脅迫下植物對水分的吸收不足以及光合作用受阻的結(jié)果［21-22］，而葉部病變則可能是高濃度鎘抑制植物對鐵、鋅、鈣、鎂、磷等元素的吸收或阻礙植物體內(nèi)錳元素運輸?shù)慕Y(jié)果［23］，因為鎘可以通過競爭細胞膜上運輸營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜載體蛋白而妨礙植物對鉀、鈣、鎂、鐵、錳、銅、鋅、鎳等元素的吸收和運輸［4，24-25］，從而導致植物出現(xiàn)礦質(zhì)營養(yǎng)元素缺乏癥［26］。然而，由于鎘對植物的影響具有多靶標、多效應、多作用位點以及全局性、復雜性、系統(tǒng)性等特點，目前對其毒理作用機制還沒有比較系統(tǒng)和完整的了解［4，27］，鎘對植物的毒性及其毒理學機制仍是將來值得深入探討的重要研究方向［5］。

圖1 鎘脅迫下玉米的形態(tài)變化及其濃度響應

定量觀測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米株高隨著鎘污染濃度的增加而降低(圖2)，根部和地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量也隨著鎘濃度的增加而趨于減少(圖3)，表明高濃度鎘對玉米莖葉生長和根系發(fā)育均有明顯的毒害效應［28］?；诓煌臏y試終點(株高、根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量)和土壤中鎘的實測濃度，分別計算得到各終點的效應濃度閾值(表1)。鎘在北京褐潮土中引起玉米幼苗株高下降1/2或?qū)е掠衩赘考暗厣喜可锪?干質(zhì)量)下降1/2的效應中濃度(EC50)分別為654．6、323．6 和110．2 mg·kg-1。

圖2 不同鎘濃度對玉米株高的影響(平均值±標準差，n=4)Fig．2 Effects of different Cd concentrations on height ofmaize seedlings(Means± SD，n=4)

表1 褐潮土中鎘對玉米株高及根部和地上部生物量的 EC10、EC20和 EC50值Table 1 Effective concentrations(EC10，EC20 and EC50)of Cd formaize height and biomass of root and shoot in fluvo-aquic soils

圖3 不同濃度鎘對玉米幼苗根部和地上部鮮質(zhì)量(A)和干質(zhì)量(B)的影響(平均值±標準差，n=4)Fig．3 Effects of different Cd concentrations on fresh(A)and drymass(B)of rootand shootofmaize seedlings(Means ± SD，n=4)

鎘對植物早期生長階段的毒害效應已得到了普遍的證明，但不同物種間幼苗的毒性響應差別很大［5，29］，即使是同種植物的不同品種(系)間對鎘脅迫的耐受性也有很大的差異［30-31］。鎘對玉米幼苗的潛在毒性也早有認識［32］，近年來，圍繞鎘對玉米的毒性效應、毒害癥狀和毒理機制開展了較為廣泛和深入的研究，所涉及的測試終點或評估指標包括鎘對玉米株高和根伸長的影響、鎘對玉米葉綠體結(jié)構(gòu)、葉綠素含量及光合作用的影響、鎘對玉米抗氧化酶活性的影響、鎘在玉米體內(nèi)的吸收與富集特性等［33-34］。其中，鎘對玉米生長的抑制作為一種易于觀測且與生態(tài)效應直接相關聯(lián)的毒性指標，在鎘的毒理評價與機理研究中使用最為廣泛。筆者的研究也表明，鎘對玉米幼苗的株高以及根部和地上部鮮、干質(zhì)量都有不同程度的抑制作用(圖2和3)。從不同測試終點的效應閾值來看(表1)，玉米地上部生物量終點的敏感性略高于根部生物量測試終點，而株高測試終點則相對不敏感。有趣的是，與鮮質(zhì)量相比，玉米根部和地上部干質(zhì)量的敏感性相對要低一些，表明針對同一評估指標(生物量)，因使用的測量方法或表征方式不同，所得到的效應濃度閾值可能會存在一定的偏差。此外，從經(jīng)濟效益和生態(tài)相關性的角度，玉米地上部莖、葉生長性狀及生物量可能是影響其未來產(chǎn)量的直接相關因素［35］，因此在選擇植物幼苗進行污染物生態(tài)效應評估時，地上部(莖和葉)生物量應該是一個較為理想的測試終點。

2．2 玉米幼苗對鎘的吸收和富集

隨著土壤中鎘污染濃度的增加，玉米幼苗根、莖和葉中鎘的濃度也相應增加(圖4)，但在相同的暴露濃度下，玉米根部組織中鎘的濃度要高于地上部組織中鎘的濃度，而玉米莖、葉中鎘的濃度則大體相當，沒有顯著的差異。其他的研究也證明，玉米吸收的鎘主要富集于根部，只有少量會轉(zhuǎn)移到地上部分［33，36］。本實驗中，相同鎘暴露濃度下玉米根部組織中鎘的濃度往往是地上部組織中鎘濃度的3～6倍，從生物富集系數(shù)(bioaccumulation factor，BAF)來看(圖5)，根部對土壤中的鎘有一定的累積富集效應(BAF＞1)，而莖、葉中鎘的濃度與相應的土壤鎘濃度基本一致，沒有明顯的富集。諸多的研究表明，植物根部中積聚的鎘的濃度往往比其他組織中鎘的濃度要高得多，鎘在植物組織間濃度分配的一般規(guī)律是:根＞莖＞葉＞果實＞種子［37］，本研究結(jié)果(圖4)基本與此相符。

圖4 土壤鎘濃度與玉米根、莖、葉中鎘濃度的關系(平均值±標準差，n=4)Fig．4 Relationship between Cd concentrations in soil and that inmaize root，stem and leaf(Means ± SD，n=4)

圖5 生物富集系數(shù)(BAF)隨土壤鎘濃度的變化Fig．5 Bioaccumulation factor(BAF)as a function of Cd concentrations in soil

2．3 鎘對玉米根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)玉米根際微生物16S rDNA V3可變區(qū)片斷DGGE指紋圖譜(圖6)，鎘污染脅迫對微生物的群落結(jié)構(gòu)有顯著的影響。與對照相比，低濃度鎘脅迫下部分微生物的種群數(shù)量有所降低(如b，e，o等3個條帶亮度變?nèi)?，而在高濃度(如 ＞1 000mg·kg-1)時，有的微生物種群完全被抑制(如h，j，n等3個條帶完全消失)，但也有一些微生物(如條帶f，g，k等所代表的種群)對鎘污染脅迫表現(xiàn)出較高的耐性，種群數(shù)量在所測試的濃度范圍內(nèi)基本不受影響，甚至有的微生物其種群數(shù)量(如條帶a，c，d，i，l，m等所代表的種群)在高濃度鎘作用下反而得到了加強，這可能與高濃度鎘抑制敏感微生物種群后，耐性微生物因種間競爭減少而得以繁盛有關［38］。

通過對玉米根際微生物的DNA片段進行測序分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)微生物種群為目前不可培養(yǎng)的細菌(表2)，但通過對不同鎘處理濃度下微生物的群落組成相似性進行UPMAGA聚類分析(圖7)，可以證明鎘污染濃度與微生物群落構(gòu)成之間存在著很好的濃度-效應關系，鎘濃度為10 mg·kg-1時微生物群落結(jié)構(gòu)與對照組最為接近(與對照的相似性達到82%)，相鄰處理濃度間(如3#、4#和5#泳道)微生物群落也具有較高的相似性，而鎘濃度為1 000 mg·kg-1時根際土壤中微生物的種類明顯減少，與對照組的Jaccard相似性指數(shù)最低(約為22%)。土壤微生物尤其是根際微生物對改善植物根系微環(huán)境，促進植物對水分和養(yǎng)分的吸收和利用有著重要的作用［39］，而鎘污染可降低土壤及植物根際微生物的種群數(shù)量［17，40］，間接影響到植物對營養(yǎng)元素的吸收，這也是鎘污染脅迫導致植物養(yǎng)分吸收不足的一種毒性作用機制。由此可見，綜合研究鎘對植物及其根際微生物的毒性影響，有助于全面揭示和了解鎘污染脅迫下植物的響應過程以及植物-微生物之間的相互作用與機制，這也是目前污染生態(tài)學重點關注的研究方向［41］。

圖6 不同濃度鎘暴露下玉米根際微生物16S rDNA片斷DGGE分析圖譜

圖7 不同濃度鎘暴露下玉米根際微生物群落組成相似性系統(tǒng)樹Fig．7 Similarity dendrogram for composition ofmaize rhizospheremicrobial community from soils treated with different concentrations of Cd

表2 測序克隆序列與GenBank最相似序列的對比結(jié)果Table 2 Alignment of sequenced clone to itsmost-similar GenBank sequence

綜上所述，可以得到以下結(jié)論:

(1)高濃度(100 mg·kg-1及以上)鎘對玉米幼苗生長發(fā)育有明顯抑制作用，鎘在北京褐潮土中引起玉米幼苗株高下降1/2或?qū)е掠衩赘考暗厣喜可锪?干質(zhì)量)下降1/2的效應中濃度(EC50)分別為 654．6、323．6 和 110．2 mg·kg-1。

(2)隨著土壤中鎘污染濃度的增加，玉米幼苗根、莖和葉中鎘的濃度也相應增加，鎘在玉米幼苗各組織中的濃度分布為根＞莖＞葉，根部對鎘有一定的累積富集效應(BAF＞1)。

(3)鎘污染脅迫對根際微生物的群落結(jié)構(gòu)有顯著的影響，在高濃度(如1 000mg·kg-1)下可顯著降低微生物的種群數(shù)量和生物多樣性。

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