魏建林

河北省邢臺(tái)市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北邢臺(tái)054001

結(jié)核病為現(xiàn)今世界上最為普遍和嚴(yán)重的人類傳染病之一，早期診斷有利于疾病的治療及預(yù)防[1]。但缺乏特異性的抗原阻礙了結(jié)核病早期快速診斷及高保護(hù)性疫苗的研制[2]。為了探討以ASN及DH單獨(dú)或者聯(lián)合INH及RFP初步對(duì)耐RFP結(jié)核菌進(jìn)行研究，該論文2011年9—12月將用多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ELISPOT篩選所得的6條肽段的細(xì)胞免疫特性，檢測(cè)指標(biāo)為多肽特異性淋巴細(xì)胞 (CD4+或CD8+T細(xì)胞)分泌的細(xì)胞因子TNF-a，IL-4,IFN-y及同時(shí)分泌兩種因子的情況。

1 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

2011年9—12月，對(duì)耐藥結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷及藥物相關(guān)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究工作，具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 青蒿素類耐藥實(shí)驗(yàn)及逆轉(zhuǎn)

2 青蒿素類單體對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的敏感性實(shí)驗(yàn)

2.1 目的

該研究針對(duì)耐INH結(jié)核菌和耐RFP結(jié)核菌進(jìn)行研究。以DHA(二氫青蒿素)和ASN（單體青蒿琥酯）單獨(dú)或者聯(lián)合INH以及RFP對(duì)其作初步研究，研究其是否具有殺死細(xì)菌，或者抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用;中藥單體配合RFP或INH是不是具有逆轉(zhuǎn)或協(xié)同結(jié)核菌耐藥性可以通過(guò)MB/BACT系統(tǒng)檢測(cè)。

2.2 材料

按相關(guān)規(guī)程——《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》對(duì)某所贈(zèng)與該院的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行鑒定 （臨床分離株為該院微生物室保存）[3]。

對(duì)絕對(duì)濃度法藥物敏感實(shí)驗(yàn)采用羅氏雞蛋固體培養(yǎng)基的方法進(jìn)行。INH的耐藥臨界值15 g/mL、RFP的耐藥臨界值505 g/mL，在該次實(shí)驗(yàn)中，一共具有13株菌株：MDR-TB：0株；INH敏感及RFP：I株；單耐 INH 或 RFP：1 株。

2.3 試劑

①M(fèi)iddle broth 7H9干粉:BD DIFCO公司產(chǎn)品。②OADC:購(gòu)自上海市結(jié)核重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。③米氏7H9液:Middle broth 7H9干粉（4.7 g）；丙三醇2 mL；加1 L去離子水，高壓滅菌后無(wú)菌添加100 mL OADC。④二氫青蒿素液:用滅菌去離子水溶解，用滅菌去離子水稀釋到20 mg/mL。⑤二青蒿琥酯液:用附帶的NaHCO3（1 mL）溶解，稀釋到20 mg/mL（用滅菌去離子水）。⑥96孔細(xì)胞培養(yǎng)板:CORNING公司產(chǎn)品。⑦RFP,INH,Resazurin(刃天青)。⑧Bact/alert MP瓶及營(yíng)養(yǎng)液。⑨金胺0-苯酚染色法。

2.4 方法

2.4.1 二氫青篙素及青蒿琥酯的抑菌作用 參照刃天青氧化還原顯色法檢測(cè)結(jié)核菌在含藥微量液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況。簡(jiǎn)述如下:用0.5%Tween 80生理鹽水研磨結(jié)核菌至乳濁狀后略沉淀，去其上層面的菌液，調(diào)至1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬ㄓ妹资?H9液），之后對(duì)其進(jìn)行稀釋，稀釋比例為：1∶10。將稀釋厚的液體加于孔板中（每孔加100 μL），之后，將稀釋后的青蒿素單體液加于孔板（每孔加入100 μL），使藥物終濃度為2 005 g/mL。對(duì)于無(wú)菌對(duì)照孔，加稀釋后的青篙素單體液 100 μL以及 7H9液100 μL。對(duì)于無(wú)藥生長(zhǎng)對(duì)照孔，加相應(yīng)菌液及7H9液各100 μL。直至第4天，將各孔中均加入20 μL刃天青貯存液，之后對(duì)各孔的顏色進(jìn)行詳細(xì)觀察和記錄（由藍(lán)色變?yōu)樽霞t色的程度），第14天，將各孔液體吸出，并進(jìn)行金胺O-苯酚熒光染色。

2.4.2 耐藥菌的作用 按照MBBACT240操作手冊(cè)進(jìn)行，比較耐藥菌在含藥液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度。為使青蒿素類單體逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥，先將青蒿素類單體與細(xì)菌相應(yīng)作用24 h后，再加入營(yíng)養(yǎng)液及RFP或INH。操作步驟簡(jiǎn)述如下:用旋渦震蕩器將菌濃度為1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏年?yáng)性結(jié)核瓶震蕩1 min后備用。一株細(xì)菌共標(biāo)記7只結(jié)核培養(yǎng)瓶，（GC.RFP/GC.INH/DHA.RFP/ASN.INH/GC.INH/ASN.RFP/DHA）;7只瓶中均注入相應(yīng)青高素單體藥液 (用生理鹽水代替青蒿素類單體注入GC.INHIGC.RFP/GC瓶)及菌液各0.5 mL，注入后要求瓶?jī)?nèi)DHA或ASN終濃度為200 μg/mL;24 h后，取出將瓶置MBBACT培養(yǎng)儀，將營(yíng)養(yǎng)液及INH或RFP貯存液(除 GC瓶外)各注入 0.5 mL，使終濃度為 2 μL/mL，最后將瓶上機(jī)培養(yǎng)。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)收集的數(shù)據(jù)運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

二氫青蒿素及青蒿琥酯的抑菌作用：通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無(wú)菌對(duì)照孔沒(méi)有變色，其他對(duì)照孔均存在變色現(xiàn)象。在14 d內(nèi)，無(wú)藥對(duì)照生長(zhǎng)孔和青蒿素單體孔雖未能變?yōu)橥耆奂t色，但都變?yōu)榉奂t色或接近粉紅色；金胺O-苯酚熒光染色顯示無(wú)藥對(duì)照孔及青蒿素單體孔均為抗酸陽(yáng)性，且細(xì)菌成團(tuán)熒光明顯增強(qiáng)，這就表明青蒿素單體孔和生長(zhǎng)對(duì)照孔均有分枝桿菌生長(zhǎng)，說(shuō)明此兩者均不能單獨(dú)抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)。

經(jīng)Fisher's exact test統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后顯示(數(shù)據(jù)不在此一一列出)，與相應(yīng)INHIGC或RFP/GC相比，青蒿素類單體聯(lián)合INH或RFP其單側(cè)P值均遠(yuǎn)＜0.05，顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RFP及INH聯(lián)合青篙素類單體對(duì)11株耐RFP或INH結(jié)核菌的效果

通過(guò)對(duì)青蒿素類聯(lián)合RFP作用耐RP結(jié)核菌的陽(yáng)性檢測(cè)時(shí)間、RFP及INH聯(lián)合青蒿素類單體對(duì)11株耐RFP或INH結(jié)核菌的效果、青蒿素類聯(lián)合INH作用耐INH結(jié)核菌的陽(yáng)性檢測(cè)時(shí)間得出的數(shù)據(jù)分析得出：對(duì)耐藥結(jié)核菌，青蒿琥酯及二氫青蒿素聯(lián)合INH或RFP均表現(xiàn)出了良好的敏感性，推測(cè)有逆轉(zhuǎn)耐INH或RFP的作用。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還說(shuō)明一個(gè)結(jié)果：二氫青蒿素的敏感率沒(méi)有青蒿琥酯的高。

4 討論

此次實(shí)驗(yàn)，少數(shù)試驗(yàn)菌株MP儀器法的結(jié)果與其羅氏法藥敏的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，針對(duì)這種形象，我國(guó)有許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究分析[4]，認(rèn)為其主要原因在于：MP系統(tǒng)藥物濃度及結(jié)敏結(jié)果更為準(zhǔn)確是因?yàn)槠渑囵B(yǎng)時(shí)間短，藥物降解更低。

該研究在設(shè)計(jì)時(shí)，為了延長(zhǎng)青蒿素聯(lián)合RFP與RFP/GC的時(shí)間差，縮短RFP/GC與GC時(shí)間差，考慮將RFP濃度定為25 g/mL，這種做法是為了更好地體現(xiàn)青素單體聯(lián)合抗菌藥物的作用，并試圖更好地將單體的效果體現(xiàn)出來(lái)。

通過(guò)該身實(shí)驗(yàn)，可以得出以下結(jié)論：體外單獨(dú)應(yīng)用青蒿琥酯或二氫青蒿素不能將結(jié)核分枝桿菌殺死或者將其抑制。通過(guò)對(duì)在此次進(jìn)行的顯色試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出：在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)不同配合體的孔板進(jìn)行認(rèn)真觀察，有少數(shù)對(duì)照孔的顏色沒(méi)有含藥孔的顏色紅，MP法中亦有菌株3081其RFP/ASN瓶比GC瓶早報(bào)陽(yáng)2.7 d，這些均表明：某些結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)可能由青蒿素類單體引起[5]。

通過(guò)該研究可以得出：對(duì)于耐藥結(jié)核分枝桿菌，INH或RFP聯(lián)合二氫青蒿素或青蒿琥酯是有效的，且青蒿琥酯比二氫青蒿素的敏感率高，其機(jī)制可能是協(xié)同或者逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥程度。

[1] 蔡江麗,秦蓮花.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白64抗體適應(yīng)的獲得及血清學(xué)檢測(cè)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2010,33(4):309-310.

[2] 王慶,金玉蓮,李建農(nóng).四種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性結(jié)果的比較及方法評(píng)價(jià)[J].中華傳染病雜志,2007,25(11):690-694.

[3] 陳芳,曾杰.DC-SIGN特異性適體的篩選及鑒定[J].細(xì)胞分子免疫學(xué)雜志,2008,24（12）:1133-1136.

[4] 張慧卿,方念.適體篩選技術(shù)[J].中國(guó)生物工程雜志,2008,28（1）:113-118.

[5] 甄蓓,宋亞軍.體外篩選碳疽芽飽適體[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),2002，34（19）:635-642.