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單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液的制備工藝

2013-08-20 00:59鄒意瓊
科技視界 2013年2期
關鍵詞:脂鈉己糖唾液酸

羅 宏 鄒意瓊

(西南藥業(yè)股份有限公司 藥物研究所,中國 重慶400038)

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialoganglioside,簡稱GM1)在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)節(jié)苷脂含量豐富,其中以神經(jīng)系統(tǒng)灰質含量最高。 GM1 是神經(jīng)細胞膜的重要組分,是唯一能透過血腦屏障的外源性神經(jīng)節(jié)苷脂制劑[1]。 GM1 能促進各種原因所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能恢復,對損傷后繼發(fā)性神經(jīng)退化有預防作用[2]。動物實驗已證明[3-4],在腦損傷早期給予單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療,可提高平均動脈壓,保護腦組織內Ca2+-ATP 酶活性,起到穩(wěn)定細胞膜的作用,防止細胞內鈣超載,改善腦組織缺血缺氧,加強能量代謝,從而減輕腦水腫,阻斷繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展。另外,單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉是一種神經(jīng)修復藥物,它可以清除自由基、保護多巴胺能神經(jīng)元,從而減輕帕金森?。≒arkinsin's Disease,PD)患者的癥狀[5]。 因此,臨床上GM1 主要用于治療急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及帕金森病。

GM1 由一個唾液酸,一個葡萄糖,二個半乳糖,一個氨基半乳糖及一個神經(jīng)酰胺殘基組成,具有水溶性和脂溶性,GM1 鈉鹽具有較好的水溶性。 且對熱穩(wěn)定性較好。 因此,將GM1 做成注射劑。 按照注射劑的質量標準,性狀、可見異物、不溶性微粒、細菌內毒素、無菌、有關物質和含量必須符合質量標準。目前,應用臨床上的GM1 制劑主要是從豬腦中提取出來的,原料中除GM1 外,還有雜蛋白、GM2、GD3和其它雜質等。 這些雜質都會對GM1 注射劑質量有影響。 因此,需要摸索GM1 注射劑的生產(chǎn)工藝, 使之盡量除去雜蛋白對注射劑澄清度的影響,同時減少有關物質的量。

1 試驗材料

1.1 藥品與試劑

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂雜質對照品(由中國藥品生物制品檢定所提供);單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液(以下簡稱GM1 注射液,自制);單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉(湖南賽隆藥業(yè)有限公司);氯化鈉(自貢鴻鶴藥業(yè)有限公司);針用活性炭(上?;钚蕴繌S);磷酸(重慶川東化工有限公司);乙晴(成都金山化學試劑有限公司)和四氫呋喃(天津市光復精細化工研究所)等。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(安揭倫科技公司)、pH 計(上海雷磁儀器廠)、紫外分光光度計(安揭倫科技公司)、不溶性微粒檢測儀(北京東方森聯(lián)自動化技術有限公司)和澄明度檢測儀(天津大學精密儀器廠)等。

2 方法與結果

2.1 GM1 注射液的制備

先加入配置總量80%的注射用水, 注射用水溫度控制在75-85℃,將氯化鈉等輔料溶解后,再加入單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉原料,,攪拌溶解。 最后加入活性炭,并保溫20 分鐘,待藥液冷卻后,用氫氧化鈉溶液調pH,通過115℃滅菌30min 后,得到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液。

2.2 GM1 含量測定

照高效液相色譜法(中國藥典2010 年版二部附錄VD)測定。

色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗: 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0.05mol/L 磷酸溶液(用三乙胺調節(jié)pH 至3.5)-乙腈(15:85)為流動相;檢測波長為205nm;理論塔板數(shù)按單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉峰計算應不低于500。

測定法: 精密移取單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液1mL 置于25mL 容量瓶中加水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(濃度為0.4mg/mL);另取工作對照品適量,精密稱定,用水定量稀釋成每1mL中約含0.4mg 的溶液,作為對照品溶液,分別取供試品溶液和對照品各溶液20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積,用外標法計算,單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉的含量應為標示量的90.0-110.0%。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果分析表

2.3 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液制備工藝的考察

2.3.1 有關指標

①藥液滅菌后pH 測定: 參照 《中國藥典》2010 版二部附錄ⅥH pH 測定法。 ②藥液可見異物檢查:按照《可見異物檢查細則和判斷標準》的規(guī)定檢查,應符合規(guī)定。 ③有關物質的測定:有關物質用高效液相法測定,單雜應不超過1.0%,總雜應不超過5%。 ④GM1 含量測定:用高效液相法測定GM1 的含量,含量應在90%~110%范圍內。

表3 實驗結果表

表4 高溫、光照試驗結果

2.3.2 正交試驗結果:根據(jù)以上實驗設計方案,對單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液工藝影響較大的幾個方面如藥液配制溫度、活性炭、滅菌溫度進行正交設計試驗,以篩選最佳處方,如表1。 結果見表2。

由表2 可知,對單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液含量的影響因素B〉C〉A,并得知最佳方案為A3B1C3。

2.3.3 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液質量檢測:按照A3B1C3方案在公司小容量注射劑車間中試放大三批, 藥液經(jīng)過0.45μm 和0.22μm 兩級過濾,灌封后通過115℃滅菌30min,樣品經(jīng)過質量檢測,結果見表3。 并且檢驗合格的第三批樣品放置在高溫(60±2)℃,相對濕度(75±5)% ;光照(4500±500)Lx 條件下10d,于第5、第10 天取樣檢測,結果見表4。 可見,用A3B1C3方案制備的注射液結果較好。

3 討論

3.1 GM1 是從豬腦中提取出的物質,原料中除GM1 外,還有雜蛋白、GM2、GD3和其它雜質等。 這些雜質都會對注射劑質量有影響。 因此必須在配制過程中保持一定溫度,使原料中的雜質通過高溫變性,并且加適量活性炭將雜質和變性后的雜蛋白除去, 同時要保證注射劑無菌,需要滅菌。

3.2 在配制過程中將藥液溫度控制在75-85℃,以除去雜蛋白。 GM1原料中有雜蛋白,雜蛋白如果控制不好,影響藥液的可見異物,根據(jù)蛋白質的性質,選擇加熱使蛋白質變性。 再通過加入活性炭吸附和過濾方式除去蛋白質。

3.3 活性炭有吸附雜質、 除去熱原等作用。 GM1 注射液中加入活性炭,將變性后的蛋白質和其它雜質除去,保證藥液可見異物符合規(guī)定,同時降低有關物質的量。 注射劑中活性炭常用量為0.01-0.5%。 但活性炭同時對GM1 有吸附作用。為保證主藥含量的準確性,進行了不同濃度活性炭對主藥的吸附的考察,從試驗結果表明,活性炭的用量為0.01%,既保證主藥含量,又能使藥液可見異物符合標準規(guī)定。

3.4 滅菌溫度的確定:根據(jù)注射劑的要求,對熱穩(wěn)定的產(chǎn)品,其F0值必須大于8,最好采用過度殺滅法,按此要求,選擇不同的滅菌溫度試驗,結果是采用過度殺滅法有關物質中單雜明顯升高,且不符合標準規(guī)定,而采用殘存概率法滅菌,其質量均符合標準規(guī)定,因此,滅菌溫度確定為115℃滅菌30 分鐘。

[1]姜靜巖,范雪亮,等.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療顱腦損傷的臨床觀察[J].西南國防醫(yī)藥,2012,22(2):144-146.

[2]姜靜巖,劉順良,李慧,等.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療急性顱腦損傷201 例[J].臨床醫(yī)藥,2011,20(7):54-55.

[3]陳志剛,盧亦成,朱誠,等.神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 在顱腦損傷早期的腦保護作用[J].第二軍醫(yī)大學學報,2002,23(4):420-422.

[4]Ledeen RW,Wu G.Nuclear lipids: key signaling effectors on the nervoussystem and other tissues [J].J Lipid Res,2004(45):1-8.

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