潘學(xué)軍　李霞　張文娥

摘 要： 【目的】為闡明緩慢生長(zhǎng)法離體保存野生毛葡萄試管苗的機(jī)制，【方法】以野生毛葡萄‘花溪-9為試材，利用緩慢生長(zhǎng)法成功離體保存了供試材料試管苗，并從葉片解剖結(jié)構(gòu)和生理生化變化2個(gè)方面闡述了毛葡萄試管苗離體保存存活率與葉片結(jié)構(gòu)和抗氧化酶活性間的關(guān)系?！窘Y(jié)果】溫度、光照和烯效唑（S3307）對(duì)野生毛葡萄離體保存效果均有影響，其影響順序?yàn)镾3307>溫度>光照，且3因素兩兩之間互作效應(yīng)明顯。野生毛葡萄在低溫（10±2）℃、光照10 μmol·m-2·s-1（12 h·d-1）和添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+ 3%蔗糖+0.5%瓊脂粉的培養(yǎng)基上保存效果良好，存活率可達(dá)86.33%。離體保存存活率較高的試管苗葉綠素含量和膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量較低，保護(hù)酶（SOD、CAT、POD）活性強(qiáng)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白含量高，葉肉細(xì)胞的緊密度提高，單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多?！窘Y(jié)論】適宜的離體保存方法增加了毛葡萄葉肉細(xì)胞的緊密度，提高了試管苗的抗氧化能力，這可能是緩慢生長(zhǎng)法離體保存成功的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞： 毛葡萄； 緩慢生長(zhǎng)法； 生理響應(yīng)； 結(jié)構(gòu)變化； 種質(zhì)保存

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0615-06

種質(zhì)資源是物種進(jìn)化、遺傳學(xué)研究及育種工作的物質(zhì)基礎(chǔ)，隨著人類生產(chǎn)實(shí)踐活動(dòng)的不斷深入和氣候的異常變化，大量資源遭到了破壞，甚至滅絕，種質(zhì)資源保護(hù)已成為一項(xiàng)世界性課題[1-5]。田間種植保存費(fèi)用高，且仍面臨著資源損失的危險(xiǎn)；種子庫(kù)保存則對(duì)有性繁殖困難的果樹資源無能為力[5]。自離體保存策略[6-7]提出以來，該項(xiàng)技術(shù)受到了果樹科學(xué)工作者的高度重視，已成功應(yīng)用到多種果樹種質(zhì)資源的保存中[8-12]。目前關(guān)于果樹種質(zhì)資源離體保存研究主要集中在保存方法的探索、改良及遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)方面[12-18]，較少見到離體保存過程中保存材料的生理機(jī)制變化方面的研究，而探討離體保存材料的生理變化機(jī)制與離體保存條件的關(guān)系，可深入了解離體保存的機(jī)制，有針對(duì)性地調(diào)整保存條件，增強(qiáng)方法探索中的針對(duì)性。本文以中國(guó)野生毛葡萄優(yōu)株‘花溪-9為試材，研究了不同離體保存條件下‘花溪-9保存10個(gè)月后的相關(guān)形態(tài)和生理指標(biāo)變化，并探討了離體保存存活率和各項(xiàng)指標(biāo)間的關(guān)系，以期探討野生毛葡萄離體保存過程中生理響應(yīng)機(jī)制，為野生毛葡萄離體保存提供科學(xué)的方法；并為探討果樹資源離體保存機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以野生毛葡萄（Vitis heyneana Roem. & Schult ）優(yōu)株‘花溪-9離體快速繁殖的組培苗為試材。試驗(yàn)于2009—2010年在貴州省果樹工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與離體保存保存方法

1.3 離體保存植株的生長(zhǎng)及生理指標(biāo)測(cè)定

1.4 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察

選取保存效果最好的葉片進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)觀察，以T0為對(duì)照。剪取葉柄上方1 cm處長(zhǎng)約5 mm葉片小塊，立即放入FAA溶液中固定；采用常規(guī)制片法制片，在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察，并用Motic Image Advances3.2軟件采集圖片并測(cè)量單位面積柵欄組織和海綿組織細(xì)胞個(gè)數(shù)。30次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS分析軟件進(jìn)行多因素方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體保存對(duì)毛葡萄存活率及植株生長(zhǎng)狀況的影響

離體保存效果的好壞取決于離體保存時(shí)間的長(zhǎng)短和保存存活率的高低。離體保存條件下，植株存活率高，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，保存時(shí)間較長(zhǎng)，則適合該物種離體保存。由表2可見，與對(duì)照相比，離體保存10個(gè)月后，毛葡萄的存活率不同程度的下降，但不同方法間差異很大，其存活率高低順序?yàn)門1>T4>T2>T6>T7>T8>T5>T3>T9。結(jié)合植株生長(zhǎng)情況來看（圖版-T0～T9），在T1保存條件下，保存存活率最高，且植株生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，保存效果最優(yōu)；其次是T2、T4和T7，但3者的長(zhǎng)勢(shì)略強(qiáng)；盡管T8的存活率略低，但在此條件下，毛葡萄生長(zhǎng)較為緩慢，也可用于毛葡萄的離體保存。多因素分析表明，光照、溫度及生長(zhǎng)抑制劑S3307對(duì)野生毛葡萄存活率和生長(zhǎng)勢(shì)均有顯著的影響，且不同的因素間互作效應(yīng)顯著；3個(gè)影響因素中S3307的影響最為明顯，其次是溫度，光照的影響相對(duì)較?。ńY(jié)果未列出）。

2.2 毛葡萄離體保存對(duì)生理特性的影響

2.2.2 離體保存條件下毛葡萄葉片丙二醛含量變化 由圖2可見，不同的離體保存條件下毛葡萄葉片內(nèi)MDA含量差異很大。與對(duì)照相比，T1、T2、T8保存條件下，葉片MDA含量有所降低，而其他6個(gè)保存條件下葉片內(nèi)MDA含量不同程度的上升，其中T3、T9條件下，葉片MDA含量升高幅度最大。盡管MDA含量高低與離體保存存活率并非一一對(duì)等關(guān)系，但是，存活率較高的保存方法，如T1，其葉片MDA含量較低；保存效果較差的方法，葉片MDA含量也較高，如T3、T9。

2.4 離體保存存活率與生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表4可見，離體保存存活率與葉綠素含量和MDA含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但均未達(dá)到顯著性水平，說明葉綠素、MDA含量較低的情況下，存活率有升高的趨勢(shì)，但二者間相關(guān)性不強(qiáng)。存活率與葉片內(nèi)保護(hù)性酶（SOD、POD、CAT）活性和可溶性蛋白質(zhì)含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明葉片內(nèi)保護(hù)酶活性越強(qiáng)，可溶性蛋白含量越高，存活率越高。而SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白含量?jī)蓛芍g均表現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系，葉綠素含量與SOD活性和可溶性蛋白含量顯著負(fù)相關(guān)，表明離體保存條件下，毛葡萄葉片SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白含量4者之間高度正向協(xié)同變化。而綠葉素含量與SOD活性和可溶性蛋白含量則高度負(fù)協(xié)同變化。

3 討 論

緩慢生長(zhǎng)保存是一種中期保存方法，影響保存效果的因素很多，但主要是培養(yǎng)條件（光照和溫度）和培養(yǎng)基組分[21-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫（10±2）℃和光照10 μmol·m-2·s-1（12 h·d-1）條件下，毛葡萄帶頂芽的莖段接種到添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+ 3%蔗糖+0.5%瓊脂粉的培養(yǎng)基上不需繼代保存10個(gè)月，存活率可達(dá)86.33%。多因素分析表明光照、溫度及生長(zhǎng)抑制劑S3307對(duì)野生毛葡萄存活率和生長(zhǎng)勢(shì)均有顯著的影響，這與前人的研究結(jié)果相一致[12，14-15，17]。不同的因素間互作效應(yīng)顯著，3個(gè)影響因素中S3307的效果最為明顯，其次是溫度，光照的影響相對(duì)較小。

離體保存過程中，低濃度（0.1 mg·L-1）植物生長(zhǎng)延緩劑（烯效唑）可有效減緩毛葡萄試管苗生長(zhǎng)，利于離體保存，而高濃度烯效唑（1.0～2.0 mg·L-1）對(duì)毛葡萄試管苗生長(zhǎng)存在毒害作用，不利于離體保存，這與李朝周等[14]對(duì)葡萄栽培品種的保存濃度有所差異；低溫條件下葉綠素和蛋白質(zhì)合成代謝過程中部分酶活性受到一定程度的抑制，葉綠素和蛋白質(zhì)合成速率降低，導(dǎo)致葉綠素含量的降低和生長(zhǎng)速率的減緩；組培條件下，試管苗生長(zhǎng)主要依靠異養(yǎng)條件，但自養(yǎng)能力同樣存在，光照條件的減弱進(jìn)一步抑制了試管苗的光合作用，從而進(jìn)一步延緩了試管苗的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)保存時(shí)間[17]，因此低溫和弱光也是毛葡萄試管苗離體保存的可行途徑。

對(duì)于果樹種質(zhì)資源離體保存研究多集中在保存方法的優(yōu)化和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)上[11-12，18]，果樹種質(zhì)保存過程中生理代謝及細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)變化方面的研究相對(duì)較少，也未見離體保存影響因素與生理指標(biāo)的關(guān)系研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，離體保存10個(gè)月后的野生毛葡萄生理狀態(tài)發(fā)生了改變，存活率較高的配方（如T1）下的試管苗葉綠素含量和膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量較低，保護(hù)酶（SOD、CAT、POD）活性強(qiáng)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白含量高；反之，存活率較低的離體保存條件下（如T9）的試管苗葉綠素含量和MDA含量較高，保護(hù)酶活性弱，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白含量低。

離體保存存活率與葉綠素含量、MDA含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)未達(dá)顯著水平，而與保護(hù)酶活性和可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。說明離體保存條件下，葉片生理狀態(tài)影響離體保存效果，離體保存過程中，葉綠素含量的適度降低，可減弱光合代謝，利于離體保存；而保護(hù)酶活性和可溶性蛋白含量的升高，可有效抑制活性氧產(chǎn)生，使膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA維持在較低的水平，從而提高了離體保存存活率。這與膜質(zhì)過氧化水平低和保護(hù)酶活性高有利于種子保存的結(jié)論相一致[25-26]。本研究還發(fā)現(xiàn)離體保存條件下，試管苗葉肉細(xì)胞的緊密度發(fā)生了改變，單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多，由此推斷這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的變化可提高試管苗的抗逆性，利于離體保存。

本研究中僅研究了野生毛葡萄‘花溪-9離體保存下的組織結(jié)構(gòu)及生理響應(yīng)，不同基因型果樹離體保存條件差異很大，離體保存條件下其他果樹的生理和形態(tài)響應(yīng)機(jī)制需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

野生毛葡萄在低溫（10±2）℃、光照10 μmol·m-2 ·s-1 （12 h·d-1）和添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+3%蔗糖+0.5%瓊脂粉的培養(yǎng)基上保存效果好，存活率可達(dá)86.33%。適宜的離體保存方法增加了野生毛葡萄葉肉細(xì)胞的緊密度，提高了試管苗的抗氧化能力，這可能是緩慢生長(zhǎng)法離體保存成功的重要機(jī)制之一。（本文圖版見封底）

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