陳艷紅

（山東省萊蕪市人民醫(yī)院 山東 萊蕪 271100）

近年來以冠脈血栓和腦血栓為主的血栓栓塞性疾病的發(fā)病率呈上升趨勢，靜脈血栓栓塞導(dǎo)致的死亡排在心腦血管疾病和惡性腫瘤之后的第三位，嚴(yán)重危害人類的健康。因此，尋求積極的預(yù)防及治療方法尤為重要，該研究通過做動物實(shí)驗(yàn)的方法，觀察通脈活絡(luò)膠囊治療血栓性疾病的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探討其作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供安全、有效的方法，該研究的目的通過觀察通脈活絡(luò)膠囊的工藝制備，探討其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為臨床應(yīng)用提供質(zhì)量保證，以獲得治療血栓性疾病的藥理作用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用寒冷刺激加腎上腺素造成血瘀模型等方法，觀察通脈活絡(luò)膠囊的毒理、藥理的作用機(jī)制。研究如下：

1 制備工藝

1.1 處方組成：通脈活絡(luò)膠囊的藥物組成：僵蠶9g，水蛭9g，海風(fēng)藤12g，陳皮12g，澤瀉9g，豬苓9g，續(xù)斷9g，澤蘭12g，牛膝9g，丹參12g，川芎12g，赤芍12g，紅花12g，桃仁10g。

1.2 制備工藝

1.2.1 制備方法：將以上中藥一十司味，如法炮制，烘干，配料、粉碎過100目篩，混勻，裝0號膠囊使每粒膠囊裝0.4g的藥粉，即得。

1.2.2 生產(chǎn)工藝流程：炮制→配料→烘干→粉碎→過100目篩→混勻→裝0號膠囊→包裝→檢驗(yàn)→合格→入庫。

1.3 質(zhì)量控制

［性狀］本品為膠囊劑，其內(nèi)容物為淺黃色粉末、味苦。

［鑒別］取本品內(nèi)容物粉末2g，加石油醚（60-90℃）10 ml，超聲處理30分鐘，濾過、濾液蒸干，殘?jiān)邮兔眩?0-90℃）1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取赤芍對照藥材l g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點(diǎn)于同一硅酸G薄層板上，以石油醚（60-90℃）一乙酸乙酯一醋酸（10：3：0.1）為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外光燈（365n m）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

［含量測定］水蛭含量測定照高效液相色譜法（參閱中國藥典2005版附錄ⅥD）測定.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液一醋酸一異丙醇（67∶173∶4∶4）為流動相；檢測波長為230n m.理論板數(shù)按水蛭素峰計(jì)算應(yīng)不低于1500.對照品溶液的制備：精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36小時(shí)的水蛭素對照品適量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，搖勻，即得。供試品溶液的制備：取該品中粉約0.5g，精密稱定，置20 ml量瓶中，加甲醇約18 ml，浸泡4小時(shí)，超聲處理（功率150 W，頻率20k Hz）30分鐘，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μI，注入液相色譜儀，測定，即得。該品含水蛭素（C23 H28O11）不得少于0.80%.

［檢查］本品應(yīng)符合膠囊劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定（參照《中國藥典》2005年版一部附錄IL）。

2 動物實(shí)驗(yàn)藥理作用研究

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 藥品：通脈活絡(luò)膠囊（處方組成：僵蠶9g，水蛭9g，海風(fēng)藤12g，陳皮12g，澤瀉9g，豬苓9g，續(xù)斷9g，澤蘭12g，牛膝9g，丹參12g，川芎12g，赤芍12g，紅花12g，桃仁10g）。將以上中藥按照配方配料，先行炮制、烘干、粉碎、過100目篩、混勻，取上述藥粉裝0號膠囊，使每粒膠囊裝藥粉0.4g即得。臨用前用蒸餾水配成不同濃度備用。

2.1.2 陽性對照藥：消栓通絡(luò)片，批號：20100601。

2.1.3 試劑：戊巴比妥鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號WS20080401；膠原蛋白，Sig ma，批號：9879；鹽酸腎上腺素.批號：0809301；冰醋酸，批號：08083l；氫氧化鈉，批號：2008228；活化部分凝血活酶（APTT）時(shí)間測定試劑盒，北京世堂帝科學(xué)儀器公司，批號：STG2020l-27；凝血活酶原（TT）時(shí)間測定試劑盒，北京世帝科學(xué)儀器公司，批號：STG10101-27；凝血酶（TT）時(shí)間測定試劑盒，北京世帝科學(xué)儀器公司，批號STG20802-19；血小板誘導(dǎo)劑（ADP），北京世帝科學(xué)儀器公司。

2.1.4 動物：二級昆明種小鼠，雄雌各半，體重1 8～22g；SD大鼠，雌雄各半，體重250～350g，均由市藥檢所實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，生產(chǎn)合格征號：魯?shù)?011-005號。

2.2 方法

2.2.1 通脈活絡(luò)膠囊對凝血功能的模型制備：60只小鼠隨機(jī)分為正常、陽性、消栓通0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五組，每組12只，每天給藥1次，連續(xù)給藥14d，于末次給藥后1h，將小鼠尾尖1 c m處用利剪剪斷，它即秒表開始計(jì)時(shí)，至血液凝固為止即為出血時(shí)間［1］。血液自動流出.用濾紙吸去第1滴血后，將血滴于清潔載玻片兩端各1滴，立即秒表開始計(jì)時(shí)，用6號干燥針頭沿血滴邊緣向里輕輕挑動血滴，至針頭能挑起纖維蛋白絲為止.即為凝血時(shí)間。

2.2.2 通脈活絡(luò)膠囊對血瘀大鼠血小板聚集率及凝血因子的模型制備：60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組、通脈活絡(luò)膠囊0.20g／kg、0.40g／kg、0.80g／kg六個(gè)劑量組，除正常對照組外，各組均造成血瘀模型。造模：參照文獻(xiàn)［2］復(fù)制血瘀模型，但鹽酸腎上腺素（Adr）的劑量及冰凍時(shí)間有所改變，具體操作如下：將1 mg／mL的Adr用生理鹽水稀釋1倍，第1d每隔4h皮下注射0.2 mL稀釋后的Adr，共給3次。在每2次給藥的中間時(shí)間將大鼠放入0～2℃冰水中4 min進(jìn)行冷刺激；第2d仍按的日劑量給予2次Adr（間隔4h），在2次給藥的中間時(shí)間將大鼠放入冰水中3 min進(jìn)行1次冷刺激，模型即造成。48h后大鼠1%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）行腹腔麻醉，腹腔靜脈取血，置于3.8枸櫞酸鈉抗凝管中。離心，測定血小板聚集率和凝血因子［3］。

2.2.3 通脈活絡(luò)膠囊對膠原蛋白腎上腺素誘發(fā)小鼠體內(nèi)血栓形成的模型制備：取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分成正常組、陽性組、通脈活絡(luò)膠囊0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五組，給藥14d，各組于末次給藥后1h，每只小鼠尾靜脈注射膠原蛋白腎上腺素混合血栓誘導(dǎo)劑［4］。

3 結(jié)果

3.1 通脈活絡(luò)膠囊對凝血功能的影響比較：結(jié)果（見表1）顯示通脈活絡(luò)膠囊0.50g／kg、1.00g／kg給藥14d與正常對照組比較，有明顯延長小鼠凝血及出血時(shí)間的趨勢（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 通脈活絡(luò)膠囊小鼠凝血時(shí)間的影響(±s，n=12）

表1 通脈活絡(luò)膠囊小鼠凝血時(shí)間的影響(±s，n=12）

注：與對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01.

組別 n 劑量（g／kg） 出血時(shí)間（s） 凝血時(shí)間（s）正常組12 - 1150.58±40.52 127.75±65.92小劑量組 12 0.25 1225.00±38.00 171.80±67.51中劑量組 12 0.50 1528.70±40.15▲ 183.70±37.94△大劑量組 12 1.00 1550.00±44.38▲ 215.18±99.71△陽性組 12 1.00 1403.18±39.51△ 2.4.18±82.52△

3.2 通脈活絡(luò)膠囊對血瘀大鼠血小板聚集率及凝血因子的影響比較：結(jié)果（見表2～3）與正常組比較，模型組血液中TT、PT、APTT內(nèi)源性和外源性凝血功能明顯縮短，血小板聚集率顯著增高；通脈活絡(luò)膠囊0.20g／kg、0.40g／kg、0.80g／kg均能明顯降低血瘀高凝大鼠模型Ⅱ因子活性，降低血小板聚集率，抑制內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)，降低血液高凝狀態(tài)，與模型組比較有明顯差異（P＜0.05或P＜0.01）。

3.3 通脈活絡(luò)膠囊對膠原蛋白腎上腺素誘發(fā)小鼠體內(nèi)血栓形成的影響比較 取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分成正常組、陽性組、通脈活絡(luò)膠囊0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五組，給藥14d，各組于末次給藥后1h，每只小鼠尾靜脈注射膠原蛋白腎上腺素混合血栓誘導(dǎo)劑［5］，結(jié)果（見表4）表明通脈活絡(luò)膠囊0.50g／kg、1.00g／kg給藥1 4d與模型組比較，能明顯增加小鼠存活率（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 通脈活絡(luò)膠囊血瘀大鼠的血小板聚集率的影響(±s，n=10）

表2 通脈活絡(luò)膠囊血瘀大鼠的血小板聚集率的影響(±s，n=10）

注：與正常組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01與模型組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01。

組別 n 劑量（g／kg） 血小板聚集率（%）正常組10 - 16.73±3.04模型組 10 - 27.36±4.68▲小劑量組 10 0.20 21.26±2.14△◇中劑量組 10 0.40 19.13±3.55▲大劑量組 10 0.80 18.55±3.20◆陽性組 10 0.80 23.24±2.82▲◇

表3 通脈活絡(luò)膠囊血瘀大鼠凝血因子的影響 （±s，n=10）

表3 通脈活絡(luò)膠囊血瘀大鼠凝血因子的影響 （±s，n=10）

組別 劑量 TT（s） PT（s） APTT（s）正常組- 30.06±2.78 15.21±1.90 36.84±3.91模型組 - 20.25±7.83▲ 7.40±0.35▲ 25.93±2.09▲小劑量組 0.20g／kg 28.05±5.19◇ 11.20±1.07◇ 30.81±3.39◇中劑量組 0.40g／kg 30.74±3.09◆ 14.76±1.33◆ 36.01±2.49◆大劑量組 0.80g／kg 29.30±2.68◆ 15.10±1.50◆ 37.25±1.34◆陽性組 0.80g／kg 27.16±3.38△◇ 17.38±1.77△◇ 35.00±2.32◆

表4 通脈活絡(luò)膠囊對小鼠體內(nèi)血栓形成的影響（n=12）

4 討論

4.1 病因和發(fā)病機(jī)制：本病的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全明確，但近年的研究表明血栓性疾病的發(fā)生、發(fā)展主要與下列6種因素有關(guān)：血管內(nèi)皮損傷當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞因機(jī)械（如動脈粥樣硬化）、化學(xué)（如藥物）、生物（如內(nèi)毒素）、免疫及血管自身病變等因素受損傷時(shí)，可促使血栓形成。其發(fā)病機(jī)制為：①內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮細(xì)胞TF過度表達(dá)及釋放，外源性凝血途徑激活；②血管完整性破壞，F(xiàn)Ⅶ激活，內(nèi)源性凝血途徑啟動；③血小板粘附、聚集、釋放反應(yīng)增加；④內(nèi)皮細(xì)胞受損，ET釋放，致血管收縮、血流受阻。血小板數(shù)量增加，活性增強(qiáng)各種導(dǎo)致血小板數(shù)量增加、活性增強(qiáng)的因素，均有誘發(fā)、促進(jìn)血栓性疾病發(fā)生的可能性，如血小板增多癥、機(jī)械、化學(xué)、生物及免疫反應(yīng)等導(dǎo)致的血小板破壞加速等。其致病機(jī)制與激活凝血反應(yīng)等密切相關(guān)，詳見本篇第十五章。目前認(rèn)為，血小板因素在動脈血栓形成（如心肌梗死）的發(fā)病中有更為重要的地位。血液凝固性增高在多種生理及病理狀態(tài)下，人體凝血活性可顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為某些凝血因子水平升高或活性增加，如妊娠、高齡及創(chuàng)傷感染等所致的應(yīng)激反應(yīng)、高脂血癥、惡性腫瘤等。而高凝狀態(tài)是血栓性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)?？鼓钚詼p低人體生理性抗凝活性減低，是血栓形成的重要條件。引起人體抗激活性減低的常見原因有：①AT減少或缺乏；②PC及PS缺乏癥；③由FV等結(jié)構(gòu)異常引起的抗蛋白C現(xiàn)象（APC-R），近年研究發(fā)現(xiàn)，在歐美白人反復(fù)發(fā)生深部靜脈血栓形成或有陽性家族史的深部靜脈血栓形成（DVT）患者中，APC-R的發(fā)生率高達(dá)60%；④肝素輔因子Ⅱ（HC-Ⅱ）缺乏癥等。纖溶活力降低臨床常見有：①纖溶酶原結(jié)構(gòu)或功能異常，如異常纖溶酶原血癥等；②纖溶酶原激活劑（PA）釋放障礙；③纖溶酶活化劑抑制物過多。這些因素導(dǎo)致人體對纖維蛋白的清除能力下降，有利于血栓形成及擴(kuò)大。血液流變學(xué)異常各種原因引起的血液粘滯度增高、紅細(xì)胞變形能力下降等，均可導(dǎo)致全身或局部血流淤滯、緩慢，為血栓形成創(chuàng)造條件。如高纖維蛋白原血癥、高脂血癥、脫水、紅細(xì)胞增多癥等。它可通過以下機(jī)制促進(jìn)血栓形成：①紅細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成紅色血栓；②促進(jìn)血小板與內(nèi)皮的粘附及聚集，增強(qiáng)血小板活性；③損傷血管內(nèi)皮，啟動凝血過程。

4.2 中醫(yī)藥理探討：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，與本病有關(guān)的因素有靜脈血流滯緩、靜脈壁損傷、血液的高凝狀態(tài)及妊娠分娩、肥胖、老年、心臟病、惡性腫瘤、口服避孕藥等。本病相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的“股腫”，是由創(chuàng)傷、手術(shù)、妊娠、分娩、惡性腫瘤及因其它疾病而長期臥床，或長途乘車，以致久臥傷氣，血行緩慢，以致瘀血阻于脈中；或因飲食不節(jié)，素食膏粱厚味，濕熱內(nèi)生，流注于血脈，濕熱與瘀血互結(jié)，阻于絡(luò)道所致。脈絡(luò)滯塞不通，不通則痛；營血回流受阻，水津外溢，聚而為濕，停滯于肌膚則腫；血瘀脈中，瘀久化熱，故患肢溫度升高?？傊?，絡(luò)脈血凝濕阻是本病的主要病機(jī)。針對這一病機(jī)，急性期在應(yīng)用尿激酶溶栓抗凝的同時(shí)，以中醫(yī)通脈活血、利濕消腫為治療原則，自擬通脈活絡(luò)膠囊治療。方中桃仁、紅花、水蛭、赤芍、川芎、丹參活血化瘀通脈，其中川芎行血活血，走而不守；用澤蘭、取其行氣利水消腫、活血化瘀通脈的雙重功效，且行而不峻，祛瘀而不傷正，對肢體腫脹療效明顯；陳皮理氣行氣，使氣行則血行，血行脈自通；澤瀉、豬苓淡滲利濕消腫；牛膝引諸藥直達(dá)病所；僵蠶、海風(fēng)藤祛風(fēng)定驚，散結(jié)止痛；續(xù)斷有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、調(diào)血脈。諸藥合用，共達(dá)通脈活血、利濕消腫之目的。辨病和辨證相結(jié)合，以病為綱，病證合參，提高了療效，發(fā)病后能迅速控制病情，使靜脈再通，不遺留后遺癥或少留后遺癥，既縮短了病程，也降低了病殘率。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局中藥新藥研究指南（藥學(xué)藥理學(xué)毒理學(xué)）：［M］.2004：172

［2］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：564-566

［3］張強(qiáng)宗，劉俊田，史小蓮，等.水蛭免加熱提取物對高凝動物模型凝血系統(tǒng)及血小板聚集率的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006。1 2（5）：47-49

［4］謝輝.許惠琴.李虹.韭白向提取物對小鼠凝血時(shí)間及體內(nèi)血栓形成的影響［J］時(shí)珍國醫(yī)國藥.2004.1 5（1 2）：811-812

［5］陳領(lǐng)朝，連秀峰.袁秉祥，等.腦絡(luò)舒通膠囊對大鼠實(shí)驗(yàn)性腦及動靜脈血栓形成的藥效與研究［J］.陜西中醫(yī).2002，23（4）376-377