楊妍梅，馮若飛，馬忠仁

（1.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730030；2.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030）

狂犬病（Rabies）俗稱瘋狗病，又稱恐水癥，是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一種人畜共患的急性接觸性傳染病，發(fā)病后病死率幾乎為100%。我國(guó)是狂犬病的高發(fā)地區(qū)，感染狂犬病死亡人數(shù)居世界第二，僅次于印度。當(dāng)今世界，狂犬病仍然是一種高發(fā)的人畜共患病，無論在發(fā)達(dá)國(guó)家［1］，還是發(fā)展中國(guó)家［2］，都是重點(diǎn)防控的傳染病?？袢≡谖覈?guó)曾一度得到有效控制，值得關(guān)注的是我國(guó)城鄉(xiāng)養(yǎng)犬、貓等寵物的家庭迅速增加，野犬、貓的數(shù)量均呈現(xiàn)增多趨勢(shì)［3］，使該病的發(fā)病率近年有上升趨勢(shì)。

狂犬病病毒是彈狀病科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒屬的成員，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)度為11 928nt～11 932nt，編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，順次為核蛋白（N）、磷酸蛋白（M1）、基質(zhì)蛋白（M2）、糖蛋白（G）和 RNA聚合酶（L），分別由對(duì)應(yīng)的5種結(jié)構(gòu)基因編碼，其中N基因具有毒株間相對(duì)保守和高拷貝復(fù)制的特點(diǎn)，成為病毒分型、系統(tǒng)發(fā)生分析和分子診斷的目標(biāo)序列［4］?？袢?shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、熒光抗體技術(shù)（fluorescence antibody，F(xiàn)A）方法、快速熒光抑制灶技術(shù)（RFFIT）、反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）、熒光定量RT－PCR，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）和基因芯片（Genechip）等方法［5］。本文就這些方法在狂犬病病毒檢測(cè)上的應(yīng)用進(jìn)行歸納和總結(jié)。

1 狂犬病病毒的分離

自從1881年巴斯德把人的狂犬病病毒經(jīng)家兔傳代而分離到固定毒以來，現(xiàn)世界各地都已分離到了狂犬病病毒。狂犬病病毒的分離方法可分為兩種，一種是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離，先將含有狂犬病病毒的腦組織懸液在易感動(dòng)物體內(nèi)接種，再進(jìn)行狂犬病病毒的分離，并對(duì)易感動(dòng)物的腦組織采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)［6］。另一種是易感細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)24h～48h后，用免疫熒光檢測(cè)狂犬病病毒包涵體，即Negri小體［7］。由于細(xì)胞培養(yǎng)有許多優(yōu)點(diǎn)，可提高疫苗的質(zhì)量及病毒的含量；可以結(jié)合免疫學(xué)技術(shù)和病毒學(xué)技術(shù)發(fā)展成各種快速、簡(jiǎn)便的測(cè)定狂犬病病毒的方法，這就使在實(shí)驗(yàn)室對(duì)狂犬病病毒的研究變得容易進(jìn)行，所以它是病毒學(xué)上最常用的分離病毒的方法。

2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)在一般實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行，既可測(cè)抗原又可測(cè)抗體，快速簡(jiǎn)便，單流程數(shù)小時(shí)即可完成，適合做批量樣品檢測(cè)，價(jià)格低廉，是最適合大范圍狂犬病病毒篩查的一種方法，但是該方法存在操作過程繁瑣，與實(shí)驗(yàn)人員的熟練程度呈正相關(guān)的缺點(diǎn)。已有報(bào)道的ELISA檢測(cè)法主要有競(jìng)爭(zhēng)法、雙抗夾心法、間接法等，成功的ELISA法檢測(cè)的靈敏度和特異性都應(yīng)在85%以上［8－9］。

Feyssaguet M 等［8］報(bào) 道 的 PLATELIATM RABIESⅡELISA試劑盒采用狂犬病病毒糖蛋白包被檢測(cè)板，與RFFIT檢測(cè)比較靈敏度為98.6%，特異度為99.4%，基本上可以替代RFFIT進(jìn)行狂犬病病毒中和抗體檢測(cè)。羅金燕等［10］將狂犬病病毒糖蛋白（G蛋白）中和抗原表位串聯(lián)表達(dá)的重組蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)RABV中和抗體的間接ELISA技術(shù)。該方法與快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）的陽性符合率為88%，陰性符合率為96%，具有良好的特異性和重復(fù)性。宮苗苗等［11］以原核表達(dá)的狂犬病病毒M蛋白為檢測(cè)抗原，建立了間接ELISA抗體檢測(cè)方法，并利用該方法與商品化試劑盒同時(shí)檢93份臨床血清樣品，結(jié)果二者的符合率為89.2%，由此可見，該方法比較靈敏。Kazuak等將常規(guī)的酶聯(lián)免疫技術(shù)和微量技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)中和抗體，結(jié)果是快速熒光抑制灶技術(shù)（RFFIT）一致，并且比RFFIT快速易行。

3 熒光抗體技術(shù)

熒光抗體技術(shù)是以熒光物標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原定位的技術(shù)，熒光抗體技術(shù)包括熒光抗體染色技術(shù)（FAT）和快速熒光抑制灶技術(shù)（RFFIT）。該技術(shù)在檢測(cè)動(dòng)物和人狂犬病病毒時(shí)快速且敏感，是狂犬病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 熒光抗體方法

熒光抗體方法有直接和間接兩種，它可檢測(cè)病毒抗原，對(duì)病毒在細(xì)胞中進(jìn)行定位。該方法既靈敏、特異性又高，應(yīng)用價(jià)值非常高。該法可直接涂片檢測(cè)，也能用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)或被接種小鼠的腦組織中狂犬病病毒抗原是否存在［12］。對(duì)于新鮮病料，F(xiàn)A法可以快速得出結(jié)果，準(zhǔn)確率可達(dá)95%～99%。FA法與其他任何檢測(cè)方法相同，其可靠性主要影響因素有狂犬病病毒、樣品性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)人員的熟練程度［13］。其特異性和靈敏度，一定程度上依賴于親和力、梯度及特異性結(jié)合狂犬病病毒核蛋白的最佳熒光抗體。Sylvia Z［14］檢測(cè)了800多份來自14種不同動(dòng)物的懷疑有狂犬病病毒的腦組織，用新鮮病料同時(shí)用福爾馬林固定，熒光抗體方法檢測(cè)兩種病料的陽性結(jié)果符合率達(dá)99.8%，未出現(xiàn)假陽性，對(duì)兩種病料的特異性均達(dá)100%。因此得出結(jié)論，用FA方法檢測(cè)狂犬病病毒抗原，用新鮮病料或用經(jīng)福爾馬林固定后的病料，效果是等同的。

3.2 中和抗體效價(jià)快速熒光灶抑制試驗(yàn)

中和抗體效價(jià)快速熒光灶抑制技術(shù)（RFFIT）是世 界 衛(wèi) 生 組 織 （（World Health Organization，WHO）推薦的檢測(cè)狂犬病病毒中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法［15］，主要應(yīng)用于狂犬病疫苗的免疫學(xué)效果評(píng)估［16－17］和狂犬病病毒中和抗體替代檢測(cè)試劑和方法的評(píng)估［18－19］，是狂犬病疫苗及中和抗體診斷試劑評(píng)價(jià)的關(guān)鍵技術(shù)。

1979年，Englene等把RFFIT和微量技術(shù)結(jié)合起來測(cè)定中和抗體，與MNT比較，結(jié)果一致，并推薦為測(cè)定中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法。對(duì)RFFIT的改進(jìn)的研究一直在進(jìn)行，法國(guó)Pharpr D等［20］在RFFIT結(jié)果的自動(dòng)化判讀方面獲得成功，日本Khawplod P等［21］應(yīng)用表達(dá)綠色熒光蛋白的rHEP－GFP重組狂犬病病毒作為攻擊病毒進(jìn)行RFFIT，可以直接觀察結(jié)果。呂新軍等［22］研究表明，RFFIT檢測(cè)體系穩(wěn)定性良好，可用于其他樣品檢測(cè)。完善了體系靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等主要指標(biāo)的評(píng)價(jià)，同時(shí)說明他們采用與熒光顯微鏡配套的電腦成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果觀察，為RFFIT結(jié)果的觀察提供方便。吳小紅等［23］采用RFFIT和小鼠中和試驗(yàn)檢測(cè)我國(guó)抗狂犬病免疫球蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的GMT，結(jié)果兩種方法的檢測(cè)結(jié)果之間呈正相關(guān)。

常用的血清學(xué)技術(shù)除中和試驗(yàn)外，還有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接熒光抗體試驗(yàn)、交叉保護(hù)試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)以及間接免疫酶試驗(yàn)等等。近年來單克隆抗體技術(shù)也可用于狂犬病的診斷。

4 反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)

反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）是熒光抗體方法的補(bǔ)充，檢測(cè)結(jié)果較直觀，易于判定，獲得的序列能夠直接用毒株的系統(tǒng)發(fā)生分析，但是，RT－PCR檢測(cè)狂犬病病毒缺乏規(guī)范性程序，許多實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)污染或假陰性問題［24］。但由于RT－PCR能夠?qū)Ω咄繕悠返膶?shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，因此該方法還是得到了廣泛的運(yùn)用。江禹等［25］建立了能夠有效擴(kuò)增7種基因型RV基因組片段的套式RT－PCR（nested RTPCR）方法。該方法能夠檢測(cè)到4.6個(gè)TCID50的SRV9固定毒。對(duì)街毒腦組織樣品檢測(cè)的靈敏度較乳鼠腦內(nèi)接種試驗(yàn)（MIT）高出100倍，對(duì)3種鼠腦固定毒、12種犬腦街毒樣品的檢測(cè)結(jié)果與FAT檢測(cè)結(jié)果一致。Aravindh Babu R P等［26］利用3種不同引物組合評(píng)價(jià)RT－PCR快速檢測(cè)狂犬病不同動(dòng)物腦組織的的敏感性和特異性，其檢測(cè)結(jié)果與FAT檢測(cè)結(jié)果100%相符。Wacharapluesadee S等［27］利用RT－PCR方法從保存達(dá)16年的狂犬病人腦樣品中檢測(cè)出狂犬病病毒N基因的150bp目的條帶，但用免疫組化反應(yīng)中陽性率較低。Whitby J E等［28］將RT－PCR和PCR－ELISA相結(jié)合，可區(qū)分經(jīng)典的狂犬病病毒和歐洲蝙蝠狂犬病病毒，結(jié)果顯示，該法比Southern blot敏感100倍，具有快速、敏感和簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

5 熒光定量PCR檢測(cè)

熒光定量PCR檢測(cè)方法是一種敏感、快速、重復(fù)性好的高通量檢測(cè)手段。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用這一技術(shù)已經(jīng)建立了多種檢測(cè)RABV的熒光定量PCR方法。該技術(shù)自1991年首次用于RABV的實(shí)驗(yàn)室診斷以來，已成為 WHO和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法［29］，但是該方法易出現(xiàn)假陽性，這有待深入研究。

針對(duì)我國(guó)狂犬病的流行特點(diǎn)，許運(yùn)斌等［30］針對(duì)RABV N基因保守序列設(shè)計(jì)并合成了一套簡(jiǎn)并引物和TaqMan探針，在優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，建立了檢測(cè)RABV核酸的一步法熒光定量RT－PCR（qRT－PCR）檢測(cè)方法，他們建立的qRT－PCR與套式RT－PCR的符合率為100%。檢測(cè)29份新鮮和5份腐敗的臨床犬腦組織樣品，qRT－PCR與套式RTPCR均檢測(cè)出12份陽性的新鮮樣品和5份陽性的腐敗樣品。高志強(qiáng)等［29］建立了古典狂犬病病毒熒光RT－PCR檢測(cè)技術(shù)，并應(yīng)用該技術(shù)對(duì)寵物醫(yī)院提供的犬唾液樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示熒光RTPCR試驗(yàn)結(jié)果同病毒分離檢測(cè)結(jié)果均為陰性，沒有發(fā)現(xiàn)陽性樣本，但從采集的流浪犬唾液樣品中檢出了陽性樣本。Crepin P等研究表明，采用常規(guī)的RT－PCR方法可從唾液樣品或CSF樣品中檢出狂犬病病毒核酸，而且有時(shí)與死后確診結(jié)果符合率達(dá)100%［31－32］。Wakeley P R 等［33］建立了 TaqMan實(shí)時(shí)熒光RT－PCR用于檢測(cè)狂犬病病毒，結(jié)果其靈敏度高于常規(guī)的RT－PCR方法，與套式RT－PCR靈敏度相同［29］。結(jié)合TaqMan基因型特異探針的RTPCR的方法能快速有效鑒別病毒。實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)唾液樣品比傳統(tǒng)RT－PER的靈敏度高。Hughes J G等［34］設(shè)計(jì)一個(gè)檢測(cè)組織樣品狂犬病病毒RNA的TaqMan PCR方法，并證明該方法敏感性、特異性均較高。Supaporn W 等［35］利用TaqMan實(shí)時(shí)定量RT－PCR對(duì)非神經(jīng)樣本進(jìn)行狂犬病病毒RNA檢測(cè)的特異性為100%。

6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是2000年由Notomi T等［36］首先報(bào)道的一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，即核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。LAMP技術(shù)采用能特異識(shí)別靶序列上6個(gè)位點(diǎn)的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件（60℃～65℃）下，1h內(nèi)其擴(kuò)增效率可達(dá)到109～1010個(gè)數(shù)量級(jí)，具有特異性強(qiáng)、等溫靈敏、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果易判定等優(yōu)點(diǎn)，但是其有易污染的致命的缺點(diǎn)。

許丹等［37］檢測(cè)17份臨床樣本的結(jié)果顯示，LAMP法和傳統(tǒng)PCR法的敏感性一致，陽性檢出率均為23.5%。該法操作簡(jiǎn)單，整個(gè)試驗(yàn)過程比普通PCR法節(jié)省時(shí)間1.5h。黃元等［38］針對(duì)狂犬病病毒的核衣殼蛋白基因（N基因）和大轉(zhuǎn)錄酶蛋白基因（L基因）中的高度保守區(qū)段分別設(shè)計(jì)了一套引物，建立了檢測(cè)狂犬病病毒的快速一步式反轉(zhuǎn)錄－環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（RT－LAMP）方法。RT－LAMP具有良好的特異性，靈敏度比RT－套式PCR高10倍以上。該方法靈敏、快速 、簡(jiǎn)便，在基層比較適用。已有報(bào)道Saitou Y 等［39］和 Hayman D T 等［40］通過使用 RTLAMP法來檢測(cè)狂犬病病毒。

7 基因芯片技術(shù)

基因芯片（又稱DNA芯片、生物芯片）是在20世紀(jì)80年代中期提出的。基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針?；蛐酒哂行滦突?、高通量、高度平行性和高速性的特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的新基因、基因表達(dá)譜分析、藥物的研究與開發(fā)等諸多方面［41－42］。張偉等［43］在探針反相雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，融合基因芯片的基本原理、核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則和酶聯(lián)顯色技術(shù)的基本原理建立了RABV低密度基因芯片。檢測(cè)160份可疑犬的血的結(jié)果表明該方法比ELISA和 RT－PCR靈敏度高、特異性強(qiáng)［44］。王振全等［45］在靶基因的上游引物5′端標(biāo)記了生物素Biotin，提高了雜交特異性和靈敏度。診斷基因芯片由于在每份檢測(cè)樣品中都設(shè)置陽性和陰性參照，并通過分子雜交進(jìn)行確認(rèn)，有效地克服了PCR易被污染的缺點(diǎn)。利用計(jì)算機(jī)分析軟件進(jìn)行分析、確診，大大降低了在結(jié)果判斷過程中的主觀因素，使各個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果具有可比性，而且診斷基因芯片檢測(cè)樣本量越大，成本越低；不僅快速、準(zhǔn)確、敏感，而且可以同時(shí)進(jìn)行多種病毒的檢測(cè)，有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

8 總結(jié)

狂犬病是危害人類生命的重大疫病之一，急需一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法，同時(shí)，國(guó)際上也亟待一套規(guī)范化的診斷程序。血清學(xué)方法是狂犬病病毒實(shí)驗(yàn)室診斷的主要方法，快速、簡(jiǎn)便、低成本并以重組蛋白作為診斷抗原的血清學(xué)方法是現(xiàn)階段的發(fā)展趨勢(shì)。ELISA方法較為常用，適用于醫(yī)院內(nèi)大批量血液的篩查，也可用于確診。PCR方法作為血清學(xué)方法的有效補(bǔ)充，但引物的特異性和靈敏度仍待提高。RFFIT技術(shù)快速、精確和重復(fù)性好。LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)和血清學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)相似，但是其易污染。熒光定量PCR檢測(cè)是一種快速、靈敏、高特異性、污染率低以及可廣泛應(yīng)用于我國(guó)狂犬病病毒檢測(cè)的方法?；蛐酒夹g(shù)有效地克服了PCR易被污染的缺點(diǎn)，具有高的靈敏度、特異性和可靠性。未來的發(fā)展趨勢(shì)是在這些診斷方法中篩選出簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確并且成本低、易推廣的診斷技術(shù)。

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