官家明，施開(kāi)創(chuàng)，陳漢忠，莫?jiǎng)偬m

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧530001）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的一種急性、高度接觸性傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬晚期流產(chǎn)，早產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和各種年齡豬特別是仔豬的嚴(yán)重呼吸道疾病。PRRS于1987年最早發(fā)生在美國(guó)，1991年荷蘭報(bào)道了該病，此后相繼在各主要養(yǎng)豬國(guó)家發(fā)生，現(xiàn)已呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害。PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組約為15kb。根據(jù)病毒基因組的差異，PRRSV可分為歐洲型和美洲型毒株，兩種基因型毒株之間基因組差異很大，同源性?xún)H為60%左右。我國(guó)于1996年首次分離到PRRSV美洲型經(jīng)典毒株，2006年分離到PRRSV美洲型高致病性變異毒株（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP－PRRSV），2010年報(bào)道了致病性PRRSV歐洲型毒株在我國(guó)豬群的存在和流行。當(dāng)前，HP－PRRSV仍然是我國(guó)的流行優(yōu)勢(shì)毒株，并且病毒基因組處于持續(xù)變異之中，嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷該病，是采取有針對(duì)性的防控措施的基礎(chǔ)。本文就PRRSV主要檢測(cè)技術(shù)及其近年來(lái)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病毒的分離與鑒定

病毒分離是檢測(cè)PRRSV最準(zhǔn)確的一種方法。目前用于PRRSV增殖的細(xì)胞主要有原代豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophage，PAM）及來(lái)源于非洲綠猴腎細(xì)胞系的 MA－104細(xì)胞、CL2621細(xì)胞、Marc－145細(xì)胞及克隆自 Marc－145細(xì)胞的更敏感的HS.2H細(xì)胞。有報(bào)道，猴源SJPL細(xì)胞系非常適合于PRRSV復(fù)制，其產(chǎn)生的病毒滴度與Marc－145細(xì)胞相當(dāng)，可用于PRRSV的分離與研究［1］。通常選取肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟和血清等病料用于分離PRRSV。將組織勻漿上清或血清接種敏感細(xì)胞后，觀(guān)察是否出現(xiàn)特征性的細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE），主要表現(xiàn)細(xì)胞聚集、圓縮、固縮、脫落。研究發(fā)現(xiàn)，不同的病毒株適合生長(zhǎng)在不同的細(xì)胞上，有的毒株僅生長(zhǎng)在一種細(xì)胞上，有的則生長(zhǎng)在多種細(xì)胞上，但大多數(shù)毒株特別是歐洲型毒株均適應(yīng)PAM，因此在分離歐洲型毒株時(shí)應(yīng)盡量采用PAM。不同分離株在敏感細(xì)胞培養(yǎng)物上增值情況不同，有些毒株在病料接種后第一代細(xì)胞培養(yǎng)即出現(xiàn)CPE，有些毒株則需在第3代才出現(xiàn)CPE，而有些毒株則不出現(xiàn)CPE，需結(jié)合其他檢測(cè)技術(shù)如間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（indirect immunofluorescent antibody test，IFA）、免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）、反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT－PCR）等方法進(jìn)行驗(yàn)證。HP－PRRSV分離株容易在Marc－145細(xì)胞上增殖，產(chǎn)生典型 CPE［2］。

2 病毒抗原的檢測(cè)方法

2.1 病毒中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)（serum neutralization test，SN）既可用于檢測(cè)病毒抗原，也可用于檢測(cè)病毒抗體。檢測(cè)PRRSV的病毒中和試驗(yàn)于1992年首次建立并用于鑒定世界上首個(gè)PRRSV美洲型分離株（ATCC VR－2332株）。目前，病毒中和試驗(yàn)主要用于對(duì)PRRSV分離毒株的鑒定，更多時(shí)候則用來(lái)測(cè)定PRRSV 抗體［3］。

2.2 免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)

檢測(cè)PRRSV的免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）于1991年首次建立并用于鑒定世界上首個(gè)PRRSV歐洲型分離株（Lelystad virus，LV）。目前，IPMA是歐洲國(guó)家常用于PRRSV分離鑒定的方法。IPMA除可用于檢測(cè)病毒抗原，還可用于檢測(cè)病毒抗體［4］，是最早建立的PRRSV抗體檢測(cè)方法。

2.3 間接免疫熒光抗體試驗(yàn)

Benfield D A等［5］利用針對(duì)PRRSV核衣殼蛋白的單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）和異硫氰酸熒光素（fluorecein isothiocyante，F(xiàn)ITC），建立了檢測(cè)PRRSV的免疫熒光抗體試驗(yàn)（immunofluorescent antibody test，F(xiàn)A）和 IFA，用 于PRRSV分離株的鑒定及感染組織、細(xì)胞中PRRSV抗原的檢測(cè)。該法至今仍為美國(guó)及其他國(guó)家廣泛采用。陳仕龍等［6］利用針對(duì)GP5蛋白的MAb建立了IFA，并與商品化RT－PCR鑒別試劑盒進(jìn)行了比較，表明IFA與RT－PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%。袁婧等［7］以HP－PRRSV分離株接種試驗(yàn)豬制備抗血清，經(jīng)硫酸銨鹽析法提取IgG后用FITC進(jìn)行標(biāo)記，建立了FA，用于檢測(cè)病毒感染單層細(xì)胞及動(dòng)物組織切片中PRRSV抗原，與RT－PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)到96.3%。FA和IFA為PRRSV提供了一種快速、便捷、敏感、特異的檢測(cè)方法。

2.4 免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）常被用于PRRSV感染組織和細(xì)胞的病原檢測(cè)、抗原定位及甲醛固定樣本的回顧性檢測(cè)［8］。近年來(lái)，楊鴻等［9］采用免疫組織化學(xué)Envision二步法對(duì)疑似PRRS病豬肺組織的病毒抗原進(jìn)行定量、半定量檢測(cè)，證實(shí)該法可原位檢測(cè)病豬肺組織PRRSV抗原的分布。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗(yàn) （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）是目前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測(cè)技術(shù)，被廣泛用于檢測(cè)PRRSV抗體，而用于檢測(cè)PRRSV抗原則鮮有報(bào)道。翁善鋼等［10］以 兔 抗PRRSV 多 抗 作 為 捕獲 抗 體、豬 抗PRRSV多抗作為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)PRRSV的雙抗體夾心ELISA，應(yīng)用于臨床組織病料中PRRSV 的 檢 測(cè)。梁 海 霞 等［11］針 對(duì) HP－PRRSV Nsp2基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增 （nucleic acid sequence based amplification，NASBA）方法，并結(jié)合微孔板中液相雜交和酶標(biāo)顯色反應(yīng)檢測(cè)NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物，建立了檢測(cè) HPPRRSV的 NASBA－ELISA。該法可特異地檢測(cè)HP－PRRSV，靈敏度達(dá)到101.83TCID50／mL，而對(duì)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株檢測(cè)結(jié)果則為陰性。

2.6 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)（gold immunochromatography assay，GICA）是一種新型檢測(cè)技術(shù)。Zhou S H等［12］采用兩種膠體金標(biāo)記的 MAb D5（抗N蛋白）和E9（抗M蛋白），在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(xiàn)和對(duì)照線(xiàn)上分別噴上兔抗膠體金標(biāo)記MAb D5和E9、山羊抗鼠PRRS抗體，成功研制出PRRSV金免疫層析測(cè)試條，在反應(yīng)中PRRSV首先結(jié)合帶有膠體金的D5和E9的混合物，然后繼續(xù)層析與兔抗D5、D9二抗結(jié)合，最終出現(xiàn)輕微的紫紅色帶，未結(jié)合的MAb將與山羊抗鼠抗體結(jié)合而在控制帶處顯色。Li X S等［13］利用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗PRRSV N蛋白的MAb 2D7制備免疫檢測(cè)探針，將抗PRRSV N蛋白的MAb 1G7和山羊抗鼠IgG抗體印跡在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，組裝成膠體金免疫層析試紙條，建立了能同時(shí)檢測(cè)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株及變異毒株的GICA。GICA使用簡(jiǎn)便，成本低，不需特殊儀器設(shè)備，非常適合基層和現(xiàn)場(chǎng)使用。

3 病毒核酸的檢測(cè)方法

3.1 反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)

1987年之后發(fā)展起來(lái)的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）為病毒性疾病的診斷提供了一種嶄新的手段，在PRRSV核酸檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。2006年高致病性PRRS在我國(guó)發(fā)生和流行后，周丹等［14］針對(duì)Nsp2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了鑒別診斷PRRSV經(jīng)典株與變異株的一步法RT－PCR檢測(cè)方法。為應(yīng)對(duì)國(guó)內(nèi)美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及歐洲型毒株同時(shí)存在的復(fù)雜狀況，施開(kāi)創(chuàng)等［15］分別針對(duì)PRRSV Nsp2、ORF5、ORF7基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及歐洲型毒株的多重RT－PCR檢測(cè)方法。為了區(qū)分 HP－PRRSV與基因缺失弱毒疫苗株，梅林等［16］建立了可鑒別HP－PRRSV野毒株與基因缺失弱毒TJM－F92疫苗株的一步法RT－PCR，為鑒別接種TJM－F92疫苗豬群中的PRRSV野毒感染豬與疫苗免疫豬提供了方法。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)

實(shí)時(shí) 熒 光 定 量 PCR／RT－PCR 技 術(shù) （real－time fluorescent quantitative PCR／RT－PCR，F(xiàn)Q－PCR／RT－PCR）于1996年由美國(guó)ABI公司推出，是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。在檢測(cè)PRRSV核酸時(shí)常用基于SYBR GreenⅠ染料以 及 基 于 TaqMan 探 針 的 FQ－RT－PCR 方法［17－18］。在 FQ－RT－PCR 基 礎(chǔ) 上，Kleiboeker S B等［19］針對(duì)PRRSV ORF7基因及3＇UTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物及探針，建立了檢測(cè)PRRSV歐洲型和美洲型毒株的二重TaqMan FQ－RT－PCR方法。Chen N H等［20］基于 MGB探針，建立了鑒別PRRSV美洲型經(jīng)典毒株與變異毒株的二重FQ－RT－PCR方法。最近，Wernike K等［21］利用3對(duì)引物和3條TaqMan探針首次建立了能同時(shí)檢測(cè)PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株及歐洲型毒株的多重TaqMan FQ－RT－PCR方法。多重 FQ－RT－PCR方法的建立和應(yīng)用，為快速鑒別檢測(cè)日益復(fù)雜的PRRSV流行毒株提供了有效的技術(shù)手段。

3.3 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)（in situ hybridization，ISH）在PRRSV檢測(cè)中也得到了應(yīng)用。李雪梅等［22］根據(jù)PRRSV ORF6和ORF7保守序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，應(yīng)用生物素標(biāo)記，建立了檢測(cè)PRRSV核酸的ISH，并應(yīng)用于感染仔豬組織石蠟切片的檢測(cè)。Mostegl M M等［23］建立的ISH，利用甲醛固定、并經(jīng)蛋白酶K處理的組織切片，固定23周后仍能檢測(cè)到PRRSV核酸。

3.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)（gene chip technology）是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型實(shí)用的生物技術(shù)。郭煥成等［24］根據(jù)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株和變異毒株設(shè)計(jì)擴(kuò)增美洲型毒株保守序列和Nsp2基因缺失區(qū)域的二重PCR引物，并設(shè)計(jì)美洲型毒株通用寡核苷酸探針和非缺失株相對(duì)于變異株Nsp2基因缺失區(qū)域的探針，成功建立PRRSV經(jīng)典毒株與變異毒株的基因芯片鑒別方法。葉芬等［25］根據(jù)PRRSV、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型的基因組序列，設(shè)計(jì)特異性引物和寡核苷酸探針，并將探針按所設(shè)計(jì)陣列固定于表面經(jīng)氨基化修飾的玻片上，制備出寡核苷酸芯片；通過(guò)引物標(biāo)記及特異性驗(yàn)證，建立了帶標(biāo)記引物的多重PCR檢測(cè)體系，從而產(chǎn)生大量可與寡核苷酸探針特異性互補(bǔ)的帶標(biāo)記的DNA片段；將標(biāo)有熒光染料的擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上寡核苷酸探針雜交，掃描、分析芯片上熒光信號(hào)，其檢測(cè)結(jié)果與PCR／RT－PCR的符合率高達(dá)92%。

3.5 反轉(zhuǎn)錄－環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）首次出現(xiàn)于2000年，近年開(kāi)始有應(yīng)用于PRRSV檢測(cè)的報(bào)道。Rovira A等［26］分別針對(duì)PRRSV美洲型和歐洲型毒株ORF7基因設(shè)計(jì)2套引物，成功建立了檢測(cè)PRRSV的二重反轉(zhuǎn)錄 LAMP（reverse transcription LAMP，RT－LAMP）。李吉達(dá)等［27］針對(duì) PRRSV ORF7基因設(shè)計(jì)特異性引物，成功建立了能同時(shí)檢測(cè)PRRSV美洲型經(jīng)典株和變異株的RT－LAMP，其敏感性比RT－PCR高100倍，檢測(cè)結(jié)果與病毒分離的符合率為100%。而Gao M 等［28］則針對(duì)PRRSV最保守的ORF6基因設(shè)計(jì)一套引物，成功建立了能同時(shí)檢測(cè)PRRSV美洲型經(jīng)典株和變異株的RTLAMP，其敏感性比RT－PCR高100倍，與FQ－RTPCR相當(dāng)。RT－LAMP操作簡(jiǎn)單，不需復(fù)雜的儀器，非常適合基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

4 其他檢測(cè)技術(shù)

4.1 聚合酶鏈反應(yīng)與變性高效液相色譜技術(shù)

2012年，楊春華等［29］根據(jù)PRRSV ORF5基因設(shè)計(jì)特異性引物，利用RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）技術(shù)分析，建立了PRRSV的PCR－DHPLC檢測(cè)技術(shù)，其靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝／μL，對(duì)16份疑似病料的檢測(cè)結(jié)果與SYBR Green I FQ－RT－PCR 的符合率為100%。該法可用于臨床PRRSV感染的早期診斷以及分子流行病學(xué)調(diào)查。

4.2 米氏散射免疫凝集試驗(yàn)

近年來(lái)，Song J Y等［30］利用米氏散射免疫凝集試驗(yàn)（Mie scattering immunoagglutination assay）制備微流體免疫傳感器，用于檢測(cè)PRRSV美洲型毒株。該方法是在Y形的微通道中，抗PRRSV抗體被結(jié)合到高度羧酸化的聚苯乙烯微顆粒表面，并與稀釋的PRRSV組織樣本混合?？乖贵w結(jié)合引發(fā)微粒免疫凝集反應(yīng)，這種反應(yīng)通過(guò)微鉗體光纖380nm入射光束的45°角前傾光散射來(lái)檢測(cè)。該法靈敏度達(dá)到10－3TCID50／mL，高于普通 RT－PCR的10TCID50／mL 及 FQ－RT－PCR 的 1TCID50／mL，且耗時(shí)短，每個(gè)試驗(yàn)不到5min。在微流體芯片上進(jìn)行免疫凝集試驗(yàn)有望發(fā)展成為一種實(shí)時(shí)檢測(cè)動(dòng)物病原體的重要方法。

5 展望

綜上所述，PRRSV主要檢測(cè)技術(shù)的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，原有的檢測(cè)技術(shù)得到了改進(jìn)和提高，同時(shí)新的檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)和被應(yīng)用。隨著PRRSV及相關(guān)生物技術(shù)研究的不斷深入，隨著新理論新技術(shù)的不斷出現(xiàn)以及更多新儀器新設(shè)備的創(chuàng)造發(fā)明，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)將得到不斷改進(jìn)，同時(shí)全新的檢測(cè)技術(shù)將會(huì)不斷涌現(xiàn)。敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便、高通量的檢測(cè)技術(shù)將是發(fā)展的優(yōu)先方向。

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