李彥偉，劉茂軍，武昱孜，張 旭，李桂蘭，張 映，邵國青＊

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所／農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷030801）

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of Swine，MPS）的主要病原。豬支原體肺炎是一種慢性、接觸性傳染病，具有高發(fā)病率和低病死率的特點(diǎn)［1］，主要表現(xiàn)為食欲減退、發(fā)熱、咳嗽、氣喘、呼吸困難等癥狀，患病豬生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率下降，常誘發(fā)其他病原的感染，特別是免疫抑制性病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV-2），引起免疫抑制誘導(dǎo)，常因同時(shí)繼發(fā)細(xì)菌感染引起死亡，是世界上最主要的豬病之一。

Mhp缺乏細(xì)胞壁，是一種介于細(xì)菌和病毒之間的、最簡單且能夠自行繁殖的原核生物，自然宿主僅見于豬。通過發(fā)病豬的咳嗽、打噴嚏或喘氣排出體外。已有研究表明，它是一種黏膜病原體，主要存在于豬氣管及支氣管中，通過附著于豬氣管和支氣管上皮組織的纖毛而定植于呼吸道中。Mhp 在呼吸道中的附著可造成纖毛的聚集和上皮細(xì)胞的病變或壞死，甚至破壞呼吸道黏膜層，使纖毛發(fā)生萎縮或脫落，不能有效清除呼吸道中的碎片及侵入的病原菌，導(dǎo)致黏膜纖毛功能的降低，從而引起豬的呼吸道疾病。本病廣泛存在于世界各地，持續(xù)感染且難以治愈，同時(shí)由于感染豬較高的治療費(fèi)用并造成生產(chǎn)性能降低，從而給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害［2-3］。

1 豬肺炎支原體基因及其結(jié)構(gòu)

目前，已經(jīng)完成4株豬肺炎支原體的基因組測序，分別是168株、J株、7448型和232型。豬肺炎支原體232 型基因組892 758bp，G＋C 平均含量28.6%，推測有692個(gè)CDS（編碼序列），編碼的蛋白質(zhì)大小平均約388 個(gè)氨基酸。692個(gè)CDS 中，304個(gè)編碼具有功能作用的蛋白（約44%），261個(gè)編碼保守的假定蛋白，127個(gè)編碼特征性假定蛋白。其基因組中有一個(gè)獨(dú)立的16S～23SrRNA 操縱子基因，一個(gè)5SrRNA，它位于距離23SrRNA 基因100kb處，還有30個(gè)tRNA 編碼基因?；蚪M中含有很多基因家族，占總編碼序列的26.3%［4］。

在基因組的結(jié)構(gòu)上，豬肺炎支原體中幾乎不存在重復(fù)序列，但是其黏附因子P97中存在重復(fù)序列，同時(shí)P97操縱元下游的P102蛋白中也存在重復(fù)序列。啟動子下游310 bp 處可能編碼脂蛋白的mhp288中也存在10.6個(gè)重復(fù)序列（CTACCCAAAAAGATCAAA）。豬肺炎支原體重復(fù)序列的分析結(jié)果顯示，它的最小長度為25bp，出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)序列是反向互補(bǔ)的［5］。

2 黏附蛋白

由于豬肺炎支原體培養(yǎng)比較困難，培養(yǎng)基成本高，培養(yǎng)耗時(shí)長，培養(yǎng)滴度低（大多在107ccu／mL ～108ccu／mL），造成生產(chǎn)成本高，而且制備出的疫苗效力也不理想。許多證據(jù)表明，在由支原體引起的疾病中，支原體的黏附在致病機(jī)理中起著很重要的作用，幾乎所有的人類和動物支原體都是依靠黏附到宿主細(xì)胞上，然后在宿主內(nèi)定植并感染。

因此人們研究豬肺炎支原體的致病機(jī)理主要是從黏附蛋白方面入手，而現(xiàn)在研究的最多的是p36、p46、p97、p110等蛋白。研究報(bào)道表明，Mhp p36蛋白又叫乳酸脫氫酶（LDH），是細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，產(chǎn)生抗體的時(shí)間較晚，但其具有種屬特異性的抗原決定簇，它的多克隆抗體對相關(guān)菌屬的p36蛋白并沒有交叉反應(yīng)［6］。p46蛋白是豬肺炎支原體的表面膜蛋白，與其他支原體也無交叉反應(yīng)，同時(shí)又是豬肺炎支原體的主要免疫優(yōu)勢蛋白。同源性比較發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體的P46基因在Mhp種內(nèi)保守，因此常作為豬肺炎支原體檢測的靶蛋白［7］。張啟敬發(fā)現(xiàn)單克隆抗體（MAbF2G5，MAbF1B6）可抑制豬肺炎支原體黏附在豬氣管的纖毛上。這兩個(gè)單抗可以識別p97蛋白，純化的p97蛋白可結(jié)合在纖毛上抑制豬肺炎支原體的黏附，最后證明了97ku的膜蛋白p97為纖毛黏附因子。單克隆抗體MAbF1B6為纖毛阻斷抗體，它識別P97基因中的重復(fù)序列區(qū)R1區(qū)，所以說明R1區(qū)為p97蛋白中的主要抗原決定區(qū)［8］。感染Mhp后，最早產(chǎn)生的抗體是針對p97 的IgA 和IgM，比其他Mhp主要抗原的抗體早30d～60d，因此，最近幾年對p97的研究成為制備疫苗的主要抗原。p110蛋白是Chen J R 等用一種抗Mhp的單克隆抗體對豬Mhp 的細(xì)胞蛋白進(jìn)行親和層析，通過HPLC-GPC分子質(zhì)量測定得到的一種蛋白，它由一個(gè)p54蛋白亞基和2個(gè)p28蛋白亞基通過二硫鍵組成，其中前者是主要抗原蛋白亞基，為糖蛋白。在吸附抑制試驗(yàn)中表明p110是豬Mhp的黏著素蛋白，這是繼p97 之后發(fā)現(xiàn)的又一種纖毛黏著素蛋白。p110蛋白能夠抑制Mhp對纖毛的黏附，與常見的其他支原體、病毒和細(xì)菌無交叉反應(yīng)。Meens J等［9］通過肽點(diǎn)陣列又鑒定出了一個(gè)具有高免疫性的豬肺炎支原體膜蛋白Mhp366。

此外，目前發(fā)現(xiàn)的豬肺炎支原體膜蛋白還有p116、p216、p271、p107 等。雖然Mhp 與豬呼吸 道纖毛的黏附機(jī)制還沒有完全證實(shí)，但對這些黏附蛋白的研究將有利于其致病機(jī)制的研究和疾病的診斷與防治。

3 蛋白組學(xué)

自20世紀(jì)90年代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用以來，其在腫瘤、肝病、腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等研究領(lǐng)域的應(yīng)用取得了快速發(fā)展，成果顯著。近年來，該技術(shù)在豬肺炎支原體性疾病研究中開始應(yīng)用，Li Yuan Zuo等［10］用雙向電泳和質(zhì)譜分析豬肺炎支原體致病性232毒株和無致病性J株，結(jié)果顯示，在232毒株中黏附蛋白p97、p159和p102大量表達(dá)，而J株則更多表達(dá)的是糖異生中的3-磷酸甘油醛脫氫酶，及丙酮酸代謝通路中的乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。Pinto P M 等［11］通過雙向熒光差異技術(shù)結(jié)合免疫印跡和質(zhì)譜比較了體外培養(yǎng)的非致病的豬肺炎支原體J株和致病的7448 株和7442株，確定了67個(gè)表達(dá)有差異的蛋白，包括在致病株中過量表達(dá)的一些黏附蛋白，通過2DE 免疫印跡鑒定了3株支原體中p97蛋白的不同水解模式，其中豬肺炎支原體基因組中有35%是隱蔽的。在J株中鑒定出81個(gè)蛋白，而在另外兩個(gè)株中鑒定出54個(gè)蛋白，這些鑒定出的蛋白可以觀察到有一些是重疊的。豐度分析鑒定出來的蛋白表明64個(gè)蛋白是過量表達(dá)的。Calus D 等［12］應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)（2-D DIGE）研究了高低毒力的mhp分離株，找到了58個(gè)差異蛋白點(diǎn)。Cacciotto C 等［13］應(yīng)用2D DIGE研究了無乳支原體脂溶性蛋白，與無乳鏈球菌脂溶性蛋白質(zhì)組2D 圖對比，識別出40個(gè)獨(dú)特的蛋白，隨后用脂溶性蛋白型菌株P(guān)G2和2株野生型株做2D DIGE分析和質(zhì)譜分析，鑒定出了194 個(gè)差異蛋白點(diǎn)。

對于這些鑒定出來的差異蛋白，可以利用生物信息學(xué)分析技術(shù)和已知基因組序列及其相關(guān)數(shù)據(jù)庫資源對這些差異蛋白的功能信息，編碼基因信息以及其相關(guān)胞內(nèi)信號通路等信息進(jìn)行解析注釋，建立差異蛋白譜，然后應(yīng)用Western blot和免疫組織化學(xué)等相關(guān)技術(shù)，來分析和驗(yàn)證這些差異蛋白，最后進(jìn)行綜合分析，從而為豬肺炎支原體致病機(jī)理的研究提供幫助。Congli Y 等［14］通過基于凝膠的LC-MS／MS分析豬肺炎支原體的蛋白質(zhì)組，跨物種Mollicutes蛋白數(shù)據(jù)庫搜索，確定了192個(gè)含有2個(gè)以上肽鏈的蛋白，同時(shí)還有217個(gè)一肽的假定蛋白，通過檢索KEGG 數(shù)據(jù)庫確定了碳代謝途徑和核酸生物合成中的大部分酶。從而得出豬肺炎支原體的能量可能主要取決于糖代謝。這又為從蛋白組學(xué)水平對豬肺炎支原體的研究提供了一個(gè)良好的基礎(chǔ)。雖然蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)展較為成熟，各領(lǐng)域所取得的成果也較為顯著，但是在豬肺炎支原體方面，蛋白組學(xué)技術(shù)方面主要還是運(yùn)用雙向電泳和雙向熒光差異電泳技術(shù)進(jìn)行研究。雙向電泳是分析蛋白組學(xué)較為經(jīng)典的技術(shù)，但其缺點(diǎn)就是操作步驟繁瑣，靈敏度較低，重復(fù)性較差等，而雙向熒光差異電泳技術(shù)可以彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)，但其分辨率還是很低。近幾年又發(fā)展起來的iTRAQ 技術(shù)，則具有高敏感，標(biāo)記效率高，重復(fù)性好，定性和定量同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)勢，這一技術(shù)已經(jīng)在豬圓環(huán)病毒感染細(xì)胞中應(yīng)用［15］，但是在豬肺炎支原體研究中尚未見到報(bào)道。

4 細(xì)胞炎性因子

豬肺炎支原體介導(dǎo)的復(fù)雜，慢性的呼吸道疾病與呼吸系統(tǒng)免疫應(yīng)答反應(yīng)的改變或調(diào)節(jié)有關(guān)。雖然目前豬肺炎支原體誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和疾病相關(guān)炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制還不清楚，但是免疫病理學(xué)上的改變是豬肺炎支原體的一個(gè)重要組成部分。光鏡下，豬支原體肺炎的特征性病理變化為細(xì)支氣管周圍和血管周圍有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等單核細(xì)胞浸潤，隨著病程延長，B淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的浸潤將會促進(jìn)類胚中心淋巴小結(jié)的形成。

豬肺炎支原體感染引起的單核細(xì)胞浸潤對機(jī)體的兩大免疫有影響，包括來源于先天免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞和獲得性免疫系統(tǒng)的B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞。Tajima等通過證實(shí)切除胸腺的豬用抗胸腺血清處理后接種豬肺炎支原體所引起的肺炎較輕，從而進(jìn)一步證實(shí)了免疫系統(tǒng)在豬支原體肺炎致病機(jī)理中的作用。這些結(jié)果表明一個(gè)由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制在肺炎的發(fā)展中可能有非常重要的作用［2］。

2004年Rodriguez F等通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測自然感染豬肺炎支原體。在支氣管和淋巴組織的增生細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了炎性因子和調(diào)節(jié)因子（特別是IL-2、IL-4和TNF-α，局部檢測到IL-1（α，β）和IL-6）。在感染豬的支氣管肺泡中檢測到IL-1β、TNF-α，肺泡隔的單核細(xì)胞中檢測到IL-6、IL-8。Choi C等在感染豬肺炎支原體35d后的豬肺病樣中，通過RT-PCR、形態(tài)學(xué)分析及原位雜交檢測到IL-1、TNF-α和IL-6這3個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)。劉朋軍［16］在探討豬肺炎支原體對免疫細(xì)胞因子IL-1β的影響試驗(yàn)中，用ELISA 檢測白細(xì)胞介素（IL-1β）在攻毒后7、14、21d后的含量，結(jié)果表明，攻毒組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清IL-1β含量都高于空白對照組。方曉敏等［17］通過PCR-SSCP技術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)豬群TLR2、TLR4基因SNPs分布，對其中部分SNP 不同基因型豬的肺部巨噬細(xì)胞做LPS 感染試驗(yàn)，借助RTPCR 跟蹤不同時(shí)間點(diǎn)豬TLR2、TLR4 基因及促炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)變化，從而發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)下的豬肺部巨噬細(xì)胞促炎性因子TNF-α、IL-1β均表現(xiàn)不同程度的表達(dá)上調(diào)。Woolley L K 等［18］在研究感染豬肺炎支原體的豬呼吸道中纖維蛋白溶酶的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白溶酶在感染豬肺炎支原體后活性增強(qiáng)，并且與促炎性因子（TNF-α，IL-1β和IL-6）的水平呈正相關(guān)。Marchioro S B等［19］在研究肌肉注射豬肺炎支原體滅活疫苗的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對試驗(yàn)58d安樂死的豬，接種豬中IL-10和IL-12的分泌都顯著高于未接種豬，同時(shí)在接種豬的肺泡灌洗液中也檢測到IgG、IgM 和IgA。

更多的研究表明，在豬肺炎支原體感染中，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的激活導(dǎo)致一些細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，在豬支氣管肺泡管分泌液中，炎性因子也會增多，產(chǎn)生的炎性因子加劇了肺脹的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低呼吸免疫系統(tǒng)控制呼吸道內(nèi)其他病原菌的能力。雖然炎癥反應(yīng)在控制病原微生物感染中起到很重要的作用，但是豬肺炎支原體感染引起的炎癥反應(yīng)更易引起宿主細(xì)胞組織的損傷和疾病的發(fā)生。

Damte D 等［20］在研究豬肺炎支原體對小鼠 肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體誘導(dǎo)產(chǎn)生了NO，同時(shí)也檢測到了促炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)MAPK 通路，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶Ⅰ／Ⅱ（ERK1／2），P38和JUNN 末端激酶／應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK／SAPK）都參與了此過程。

雖然1993年Asai等研究感染豬肺炎支原體的豬支氣管肺泡灌洗液中的促炎性細(xì)胞因子時(shí)發(fā)現(xiàn)，信號通路參與的過程中并不成立，但是對于感染中的巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌的免疫因子通常會增加，包括TNF-α、IL-6和IL-1β。

炎性細(xì)胞因子是一類主要由免疫系統(tǒng)細(xì)胞生成的具有許多強(qiáng)大生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性多肽，可介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)在發(fā)生病毒感染時(shí)，炎性因子的研究對于免疫應(yīng)答的研究至關(guān)重要，同時(shí)能夠有效的評價(jià)免疫效果。因此，對炎性因子的研究已成為病毒感染試驗(yàn)中一個(gè)關(guān)鍵性檢測指標(biāo)。例如Silva-Campa E等［21］在豬繁殖與呼吸綜合癥病毒對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分析中發(fā)現(xiàn)，PRRSV 感染誘導(dǎo)產(chǎn)生了CD4＋CD8＋CD25＋Foxp3high 表型的T 細(xì)胞和TGF-β。Barranco I等［22］在研究豬感染PRRSV 后，淋巴結(jié)中的IL-12、IL-10、IFN-α、IFN-γ 的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染第3天，在淋巴結(jié)中就可以分析到IL-12、IFN-α、IFN-γ的表達(dá)，而IL-10的表達(dá)量卻低一些，這很可能是包括IL-10表達(dá)在內(nèi)的其他機(jī)制在誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)不穩(wěn)定的宿主免疫反應(yīng)中起一定的作用。Borghetti P等［23］研究豬圓環(huán)病毒2 型（PVC-2）感染接種疫苗和未接種疫苗的兩組豬外周血單核細(xì)胞（PBMC）中的促炎性因子和免疫細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)接種疫苗組的豬中，早期就可以檢測出大量的IL-8、TNF-α、IL-1β和IFN-γ。在病毒感染過程中，一些促炎性因子的表達(dá)有希望作為早期感染和先天性炎癥反應(yīng)效率的標(biāo)記。

當(dāng)病毒感染宿主時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活進(jìn)而產(chǎn)生炎性因子。這些因子在先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)阻止病原的入侵和復(fù)制過程中起關(guān)鍵性作用，同時(shí)能夠促進(jìn)組織對病原和被感染細(xì)胞的清除。但是，如果產(chǎn)生的細(xì)胞因子較少，免疫應(yīng)答的發(fā)生將會被推遲，不能有效的清除病原。

5 展望

豬支原體肺炎在世界范圍內(nèi)廣泛存在，一旦在豬場感染便難以控制，每年給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成百億元以上的經(jīng)濟(jì)損失。豬肺炎支原體不僅是豬呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要病原之一，而且它常誘發(fā)其他豬免疫抑制性疾病的發(fā)生。單純感染豬肺炎支原體時(shí)常引起溫和型慢性肺炎；然而，當(dāng)與其他病原混合感染時(shí)，呼吸道疾病加重，引起豬呼吸道疾病綜合征。大量研究已表明豬肺炎支原體與其他病原體具有協(xié)同感染的作用。大多數(shù)情況下，協(xié)同豬肺炎支原體感染的病原體能增加相關(guān)疾病的嚴(yán)重性和潛在的持久性［24］。

疫苗免疫是預(yù)防該病的最有效手段。但目前的疫苗都不能清除和抵御豬肺炎支原體的感染，僅能減少其感染后引起的損傷。在免疫后，Mhp仍可在豬呼吸道長期定殖，這說明豬肺炎支原體在感染中存在許多未知的機(jī)制，而豬肺炎支原體致病機(jī)制的研究是對該病進(jìn)行早期診斷、免疫預(yù)防及凈化的根本基礎(chǔ)。因此，該病防控的根本出路在于對其致病機(jī)制的研究。

隨著對豬肺炎支原體致病機(jī)理研究的不斷深入，必將對豬支原體肺炎的防控和診斷起到積極的作用。結(jié)合當(dāng)前實(shí)際情況我們今后研究工作的方向是：一方面要繼續(xù)加大基礎(chǔ)研究的科研投入，繼續(xù)研究和發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體的各種毒力因子，并揭示病原的致病因子；另一方面要從宿主與病原的相互作用出發(fā)，通過分子病理學(xué)、分子免疫學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等多方面來共同進(jìn)行研究。只有這樣才能更加全面準(zhǔn)確的解決和揭示豬肺炎支原體的致病機(jī)理，才能對豬支原體肺炎的防控起到積極的作用。

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