陳文江

自1981年確認第1例艾滋病以來，發(fā)病率急劇上升，目前全球大約有6000萬人感染HIV，其中死亡2000多萬。研究表明，天然的HIV-1包膜蛋白以三聚體的形式存在于病毒顆粒和感染細胞的表面［1］，所以，獲得模擬天然構(gòu)象的抗原蛋白對于改善包膜的免疫原性，研究包膜糖蛋白的生物學(xué)特性，為研制有效的HIV-1包膜疫苗、研究包膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)及功能提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒pBluescript SKII：原核表達載體，購自上海生工生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pcT-MTQ(由哈醫(yī)大病原課題組構(gòu)建)：含有CMV啟動子、tPA信號肽和蛋白質(zhì)三聚化模序MTQ的質(zhì)粒；HIV-1原代分離株06044：R5親嗜性，分離自黑龍江省 HIV-1感染者；宿主菌：大腸桿菌 JM109；HEK293T 細胞(ADCC No．CRL-11268)；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(日本 TaKaRa)；限制性內(nèi)切酶 EcoR I、Nhe I、Xho I(日本TaKaRa)；T4連接酶(美國 Invitrogen)；DL2000 DNA Marker(日本 TaKaRa)；ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit(美國Zymo Research)；PCR引物(上海生工生物技術(shù)生物公司)；

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 06044株gp120真核表達載體的構(gòu)建

1.2.1.1 構(gòu)建策略 首先按照真核細胞基因偏嗜性進行包膜基因密碼子優(yōu)化。PCR擴增包膜gp120基因，PCR產(chǎn)物上下游分別引入EcoR I和Xho I位點，克隆至pcT-MTQ載體的EcoR I和Xho I位點之間，刪除MTQ模序，構(gòu)建gp120單體蛋白表達載體 pcT．06044 gp120 m/co(簡稱 gp120 m)；PCR擴增gp120基因，PCR產(chǎn)物上下游分別引入EcoR I和Nhe I位點，克隆至 pcT-MTQ載體 MTQ模序基因的上游，構(gòu)建gp120三聚體蛋白表達載體 pcT．06044 gp120T/co(簡稱gp120T)。

1.2.1.2 構(gòu)建過程 先對包膜基因密碼子進行修飾，調(diào)整env基因序列的GC含量至55.56%，并合成至pBluescript SKII載體上。PCR擴增不含信號肽的 gp120基因，根據(jù)06044 env序列，設(shè)計引物。PCR產(chǎn)物的純化后，將PCR產(chǎn)物和載體pcT-MTQ雙酶切，回收目的基因和線性載體。酶切產(chǎn)物連接，利用T4連接酶，將含有相同粘性末端的基因片段pcT-MTQ和gp120連接在一起，使其形成重組的閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，對陽性克隆進行篩選及鑒定，提取疑似陽性克隆的質(zhì)粒DNA，通過雙酶切的方法驗證構(gòu)建是否成功，選取3個酶切鑒定正確的克隆送至北京Invotrogen公司進行核酸序列測定。測序結(jié)果用GeneRunner3.05軟件進行分析。

1.2.2 HIV-1 gp120包膜蛋白在293T細胞中的表達及初步鑒定

1.2.2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞 利用Lipofectamine2000將gp120蛋白表達載體gp120T或gp120 m轉(zhuǎn)染至293T細胞，使重組gp120蛋白在293T細胞中瞬時表達。轉(zhuǎn)染實驗操作參照Lipofectamine2000的說明書進行。

1.2.2.2 表達產(chǎn)物的檢測 a)樣品處理：轉(zhuǎn)染72 h后，向收獲的培養(yǎng)上清或細胞裂解產(chǎn)物中加入1/5體積的6×SDS Buffer，100℃煮沸10 min后，12000 ×g離心10 min，離心收獲上清用于SDS-PAGE檢測單體形式的gp120蛋白；向收獲的培養(yǎng)上清中加入1/5體積的6×Native Buffer，100℃煮沸30s后，8000×g離心5 min，離心收獲上清用于檢測三聚體形式的gp120蛋白。b)Western blot：配制分離膠和積層膠，上樣量20μL/孔；電泳條件為80V 30 min，160V 1.5 h。電泳結(jié)束后，將凝膠、PVDF膜、Whatman 3 mm濾紙制成轉(zhuǎn)膜“三明治”，置于半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀中，10V轉(zhuǎn)印，單體蛋白轉(zhuǎn)印2.5 h，三聚體蛋白轉(zhuǎn)印4 h；轉(zhuǎn)印后將PVDF膜置于封閉液中，4℃過夜孵育；膜浸入1：1000稀釋的Rabbit anti-gp120抗體中，37℃孵育1 h；TBST溶液洗滌3遍后，將膜浸入1：4000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗中，37℃孵育1 h；TBST溶液洗滌3遍后，TBS洗滌1遍，然后向膜上滴加化學(xué)發(fā)光底物，用LAS4000檢測發(fā)光信號。

1.2.2.3 Western blot結(jié)果分析 利用LAS4000 Image Analyzer軟件掃描并計算各個特異性gp120條帶(AU)和相應(yīng)背景(BG)的灰度值，每條條帶的實際灰度值Gx=AU-BG，以各種形式gp120蛋白的總量Gt作為100%，每種形式gp120的百分數(shù)=(Gx/Gt)×100%。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1 06044 gp120真核表達載體的構(gòu)建

2.1.1 06044 gp120基因的擴增 用特異引物擴增獲得gp120 PCR產(chǎn)物，將其在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色后，紫外燈下觀察到約1.5 kb的條帶，結(jié)果與預(yù)期片段大小基本相符。

2.1.2 陽性克隆雙酶切鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒gp120 m經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，獲得大小約為5.5kb和1.5kb的兩個片段，即分別為pcT-MTQ和gp120目的基因的酶切產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果一致；重組質(zhì)粒gp120T經(jīng)EcoR I和Nhe I雙酶切鑒定，獲得大小約為5.6kb和1.5kb的兩個片段，即分別為pcT-MTQ和gp120目的基因片段的酶切產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 06044 gp120蛋白瞬時表達結(jié)果

2.2.1 變性SDS-PAGE檢測gp120蛋白表達 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞72 h后，收獲培養(yǎng)上清和細胞沉淀，以8%SDSPAGE電泳分析蛋白表達情況。在變性條件下(1% β-ME，1.7%SDS)，單體gp120蛋白表達載體gp120 m和三聚體表達載體gp120T轉(zhuǎn)染后細胞上清中均檢測到特異性信號，蛋白大小約120KD，與預(yù)期相符。

2.2.2 非還原PAGE檢測gp120三聚體蛋白表達 在非還原條件下，其中g(shù)p120 m轉(zhuǎn)染組檢測到約120KD gp120蛋白，即gp120以單體形式存在；gp120T轉(zhuǎn)染組檢測到三種形式gp120蛋白，即單體、二聚體和三聚體。

2.2.3 gp120T轉(zhuǎn)染組不同形式gp120蛋白比例分布 利用LAS4000化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，掃描并計算，得到單體、二聚體和三聚體gp120蛋白的百分比分別為10%、14%和76%。

3 討論

HIV-1包膜糖蛋白是病毒感染靶細胞的主要媒介，同時是病毒感染后機體抗病毒免疫的主要靶點，因此，體外表達包膜糖蛋白對于研究包膜的結(jié)構(gòu)和功能，揭示病毒侵入靶細胞的機制，以及開發(fā)有效的預(yù)防性包膜疫苗具有重要意義。但是由于病毒的包膜基因具有病毒密碼子偏嗜性［2］，其序列中富含AT堿基，致使包膜蛋白在體外哺乳細胞中難以獲得高效表達。針對上述技術(shù)難題，本研究采取了相應(yīng)的應(yīng)對策略。首先根據(jù)哺乳細胞基因密碼子使用原則，人工合成包膜基因序列，解決了病毒基因偏嗜性的問題。

天然情況下，包膜糖蛋白以三聚體的形式存在于病毒表面，這種三聚體構(gòu)象是包膜發(fā)揮生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而HIV-1疫苗的早期研究也表明，可溶性的包膜糖蛋白gp120單體疫苗刺激產(chǎn)生的抗體能夠很強地與失去天然構(gòu)象的gp120上的表位作用，但并不能中和原代病毒分離株［3］。因此如何構(gòu)建可溶的維持寡聚化和天然構(gòu)象的包膜蛋白，模擬包膜的三聚體結(jié)構(gòu)是研究包膜功能和發(fā)展包膜疫苗的先決條件［4］。為了維持蛋白的三聚化構(gòu)象，向包膜蛋白的C末端引入蛋白質(zhì)三聚化模序。結(jié)合以上三個策略，本研究成功構(gòu)建了包膜gp120蛋白表達載體，并獲得單體和高比例三聚體gp120蛋白的表達［5］，在gp120三聚體表達載體中單體、二聚體和三聚體gp120蛋白的百分比分別為10%、14%和76%，為后續(xù)研究蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及研制包膜疫苗奠定了物質(zhì)與實驗基礎(chǔ)。

［1］ Liu Y，Xu Y，Lou Z，Zhu J，Hu X，Gao GF，Qiu B，Rao Z，Tien P．Structural characterization of mumps virus fusion protein core．Biochem Biophys Res Commun，2006，348(3)：916-922.

［2］ Stephens CR，Waelbroeck H．Codon bias and mutability in HIV sequences．J Mol Evol，1999，48(4)：390-397.

［3］ Ledgerwood JE，Graham BS．DNA vaccines：a safe and efficient platform technology for responding to emerging infectious diseases．Hum Vaccin，2009，5(9)：623-626.

［4］ Binley JM，Wrin T，Korber B，Zwick MB，Wang M，Chappey C，Stiegler G，Kunert R，Zolla-Pazner S，Katinger H，Petropoulos CJ，Burton DR．Comprehensive cross-clade neutralization analysis of a panel of anti-human immunodeficiency virus type 1 monoclonal antibodies．J Virol，2004，78(23)：13232-13252.

［5］ Wang S，F(xiàn)arfan-Arribas DJ，Shen S，Chou TH，Hirsch A，He F，Lu S．Relative contributions of codon usage，promoter efficiency and leader sequence to the antigen expression and immunogenicity of HIV-1 Env DNA vaccine．Vaccine，2006，24(21)：4531-4540.