張愛(ài)芳 曹義虎 徐先棟 張建銘 曾柳根 張桂芳

(1.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西南昌 330039 ;2.贛州市水產(chǎn)研究所，江西贛縣 341100;3.南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌 330039)

黑尾近紅鲌(Ancherythroculter nigrocauda Yihet Woo)隸屬于鯉科、鲌亞科、近紅屬，是長(zhǎng)江上游各支流中一種特有性魚(yú)類，與廣泛分布于各大水系的翹嘴鲌(culter alburuns Basilewsky)相比，其性情溫順，更易馴化養(yǎng)殖和捕撈，為我國(guó)目前規(guī)?；B(yǎng)殖的鲌類新品種。然而國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)黑尾近紅鲌的研究起步比較晚，僅從1997 起才開(kāi)始進(jìn)行研究，2000年以后才陸續(xù)報(bào)道黑尾近紅鲌的生物學(xué)、人工繁殖、生化成分、年齡與生長(zhǎng)的關(guān)系等相關(guān)的研究［1～5］。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者已就胚胎發(fā)育［6～7］以及池塘養(yǎng)殖試驗(yàn)［8］等方面開(kāi)展了相關(guān)研究。贛州市水產(chǎn)研究所2008年從武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所引進(jìn)黑尾近紅鲌，并展開(kāi)了人工繁殖［9］及人工養(yǎng)殖［10］的研究。本課題組已對(duì)池塘養(yǎng)殖條件下黑尾近紅鲌的可數(shù)可量性狀［11］、冬片培育技術(shù)［12］及黑尾近紅鲌幼魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)需求等展開(kāi)了研究［13］。本研究中，作者對(duì)江西贛南地區(qū)人工引種黑尾近紅鲌胚胎時(shí)序和特征的觀察研究，為其苗種繁育技術(shù)的完善提供科學(xué)依據(jù)，以期為這一特有資源在江西地區(qū)的開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)種群數(shù)量提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2012年6月28日－7月4日，在贛州市水產(chǎn)研究所進(jìn)行。

1.2 親魚(yú)的來(lái)源與選擇

1.2.1 親魚(yú)的來(lái)源

本研究中所用黑尾近紅鲌親本，均來(lái)自贛州市水產(chǎn)研究所，共計(jì)190尾，雌雄各半，全長(zhǎng)247.7±38.9mm，體重568 ±43g。

1.2.2 親魚(yú)的選擇

人工催產(chǎn)親魚(yú)參照張建銘［9］等介紹，選擇體質(zhì)健壯，無(wú)傷病，各鰭完整的鲌魚(yú)。雌魚(yú)挑選腹部膨大，前后腹部豐滿圓潤(rùn)，富彈性，腹部外突。腹部朝上時(shí)，可見(jiàn)明顯卵巢輪廓。生殖孔呈粉紅色，圓形外翻，用手輕輕擠壓有黃色卵子排出的親本。雄魚(yú)挑選鰓蓋、吻部、胸鰭條等部位珠星明顯，腹部較柔軟，生殖孔狹長(zhǎng)，凹陷，呈粉紅色，擠壓腹部，有乳白色濃稠精液流出的親本。雌雄配比為1:1。

1.3 人工繁殖及受精卵的獲得

參照張建銘［9］等研究，雌性親本使用10μg/kg LHRH－A2，1000IU/ kg HCG 及5.0mg/kg DOM 三種激素混合使用，雄性親本劑量減半。采用一次注射的方法，注射方法為腹部注射法，注射部位為胸鰭基部。催產(chǎn)時(shí)間為17:00－19:00，11h后激素產(chǎn)生效應(yīng)，此時(shí)雌魚(yú)開(kāi)始排卵，雄魚(yú)排精，6～7h 后結(jié)束。待發(fā)情后，將親魚(yú)取出，人工濕法授精，使流出的卵粒和精液混合滴在準(zhǔn)備好的裝滿水的瓷盤(pán)內(nèi)，盤(pán)內(nèi)已鋪滿干凈的載玻片(25mm×25mm)，用手拍打水面使卵均勻地粘著于玻片上，并將沾滿胚胎的載玻片放置孵化槽中進(jìn)行流水孵化，水溫為26.3～28.5℃。根據(jù)不同時(shí)期及發(fā)育的情況進(jìn)行，觀察間隔的時(shí)間有所不同。參考殷海成［7］等的報(bào)道對(duì)早期胚胎發(fā)育的觀察，每隔10～30min 取一次材料;中期胚胎時(shí)每隔0.5～1.0 h取材觀察;晚期胚胎時(shí)期每隔1.0～1.5h 取材觀察一次，每次隨機(jī)不少于5 片沾滿受精卵的載玻片，固定于4%的多聚甲醛液中。

1.4 胚胎發(fā)育的觀察

將固定好的粘有受精卵的載玻片放置于含有0.001mg 胰蛋白酶的PBS 緩沖液中，進(jìn)行消化處理，根據(jù)不同的發(fā)育時(shí)期，處理的時(shí)間分別為早期胚胎5～10mins，中期胚胎15～10mins;晚期胚胎25～35mins。取出胚胎并固定，在Olympus 顯微鏡下觀察并用數(shù)碼攝像系統(tǒng)拍照［6］。詳細(xì)記錄發(fā)育時(shí)間及各個(gè)發(fā)育時(shí)期的主要形態(tài)特征，按75%以上胚胎發(fā)育達(dá)到該期的時(shí)間，確定發(fā)育期。

2 結(jié)果

2.1 黑尾近紅鲌成熟卵特征

成熟的黑尾近紅鲌卵呈圓形，比重大于水，強(qiáng)粘性。顏色為淡紅色，透明性卵膜，卵黃呈端粒狀，成熟卵的直接為0.91 ±0.04mm(圖1)。

2.2 黑尾近紅鲌受精卵特征

精子與卵子結(jié)合后，受精卵吸水后稍稍膨脹，飽滿而富有彈性，受精卵的直徑為1.20 ±0.03mm(圖2)。受精后30min，胚胎原生質(zhì)向卵的一端流動(dòng)集中，隆起并逐漸形成凸起的胚盤(pán)，帽狀胚盤(pán)、約占卵球的1/3。受精后25 min 后，在卵黃和卵膜之間形成富含透明液體的較寬的卵周隙，卵周隙為0.3 ±0.02mm(圖3)。

2.3 卵裂期

此時(shí)期包括從2 細(xì)胞到多細(xì)胞，7個(gè)發(fā)育階段。胚胎第一次卵裂為受精后1h20min，胚盤(pán)頂端中部下陷并逐漸加深形成分裂溝，繼而將胚盤(pán)分成大小相似的兩個(gè)分裂球，此時(shí)胚胎進(jìn)入2 細(xì)胞期(圖4)，分裂方式為經(jīng)裂。1h45min 后，發(fā)生第二次卵裂，形成4個(gè)大小相等的分裂球，卵裂溝與第一次卵裂垂，此時(shí)胚胎進(jìn)入4 細(xì)胞期(圖5)，分裂方式為經(jīng)裂。第三次卵裂發(fā)生在距離受精2h05min 后，形成8個(gè)細(xì)胞，整齊排列成兩行，分裂溝平行于第一次，垂直于第二次，細(xì)胞等大(圖6)，分裂方式為經(jīng)裂，胚胎進(jìn)入8 細(xì)胞期。此后胚胎分別在受精后2h25min，2h45min，3h10min 進(jìn)行第四次、第五次和第六次分裂，形成16 細(xì)胞期，32細(xì)胞期和64 細(xì)胞期。16 細(xì)胞期，分裂方式為緯裂，分裂溝與第一次垂直，有兩個(gè)分裂面，形成2層細(xì)胞，膨大呈盤(pán)狀，分裂球大小及形狀不同，周邊較大，中間較小(圖7)。32 細(xì)胞期，有4個(gè)分裂面，分裂成4 排，2 層，每層16個(gè)細(xì)胞排列，分裂球的排列開(kāi)始不規(guī)則，邊緣分裂溝清晰(圖8)。64細(xì)胞期，此時(shí)分裂溝不明顯，分裂球大小不一，且無(wú)規(guī)則排列(圖9)。受精3h 30min 后，出現(xiàn)了水平分裂和切線分裂，分裂球越分越小，但界線尚清楚，分裂球大小不一，形狀不規(guī)則，排列不整齊，多層細(xì)胞疊加如同桑椹多細(xì)胞期即桑椹期(圖10)。

2.4 囊胚期

此階段可以分為早中晚三個(gè)時(shí)期。

囊胚早期:受精后3h50 min，分裂球進(jìn)一步分裂，細(xì)胞越分越小，數(shù)目不斷增加，分裂球細(xì)胞界限模糊，表面顯得平滑，胚胎細(xì)胞團(tuán)隆起而形成高胚胎，此期稱為囊胚早期(圖11)。

囊胚中期:受精后4h10 min，囊胚細(xì)胞向植物極移動(dòng)，卵裂繼續(xù)進(jìn)行。囊胚層開(kāi)始變薄向扁平發(fā)展，胚盤(pán)高度有所下降較囊胚早期低，界限難以分辨(圖12)。

囊胚晚期:受精后4h30 min，囊胚表面細(xì)胞進(jìn)一步的擴(kuò)散，并向卵黃囊部分下包，胎盤(pán)明顯變薄，胚胎進(jìn)入囊胚晚期(圖版13)。

2.5 原腸期

此階段包括三個(gè)時(shí)期，原腸早期、原腸中期及原腸后期。

原腸早期:受精后4h50 min，囊胚向卵黃四周擴(kuò)展下延，進(jìn)一步的外包，細(xì)胞積累在囊胚的外周邊緣形成胚芽環(huán)(圖14)。

原腸中期:受精后5 h 20 min，胚環(huán)下包約1/2，胚環(huán)增厚(圖15)。

原腸晚期:受精后6 h 30 min，胚盤(pán)下包約3/4。(圖16)。

2.6 神經(jīng)胚期

受精后10h 50 min，胚盤(pán)繼續(xù)下包，胚體背面中間加厚形成神經(jīng)板，兩側(cè)形成神經(jīng)褶，進(jìn)一步愈合形成神經(jīng)管。隨著胚層進(jìn)一步下包，卵黃栓消失，胚孔逐漸變小直至封閉(圖版17)。

2.7 器官形成期

肌節(jié)出現(xiàn)期:受精后13h20 min，胚體中部模糊的出現(xiàn)3～4 對(duì)肌節(jié)，并逐漸向前、后依次增多，胚體頭部膨大，卵黃囊為規(guī)則圓球形(圖18)。

眼基出現(xiàn)期:受精后13h40min，胚體頭部?jī)蓚?cè)向外開(kāi)始隆起，發(fā)育成為前腦、中腦和后腦原基;后端薄而寬，為尾部的發(fā)育原基。在頭部中央兩側(cè)，有一對(duì)橢圓形的突起，即眼的原基(圖19)。

眼囊期:受精后14h50 min，已見(jiàn)清晰的眼囊，性狀為橢圓形，出現(xiàn)于胚胎的前端，同時(shí)前端隆起更多，可初步的分為前腦泡、中腦泡和后腦泡。肌節(jié)數(shù)量增多，已出現(xiàn)7～8 對(duì)(圖20)。

尾芽期:受精后15h30 min，胚體逐漸展長(zhǎng)，胚體末端增厚，邊緣出現(xiàn)皮皺，在末端出現(xiàn)錐狀尾牙，游離出卵黃囊，尾芽部有一層膜狀結(jié)構(gòu)把胚體與卵黃囊隔開(kāi)，眼囊輪廓清晰，且眼囊逐漸變圓。肌節(jié)數(shù)量進(jìn)一步的增多，已達(dá)12～14 對(duì)(圖版21)。

耳囊期:受精17h30min 后，在后腦兩側(cè)出現(xiàn)耳囊，呈小泡狀。眼囊開(kāi)始內(nèi)陷成胚杯，體節(jié)15～16 對(duì)，尾芽與卵黃囊開(kāi)始分離，為耳囊期(圖22)。

尾鰭出現(xiàn)期:受精后19h30min，胚體繼續(xù)延長(zhǎng)，胚體尾部的邊緣出現(xiàn)皮褶，尾部離開(kāi)卵黃囊，出現(xiàn)尾鰭，此時(shí)還可見(jiàn)胚體呈微弱的間歇性(圖23)。

晶體形成期:受精后20h30min，脊索非常清晰，眼囊隨著胚胎發(fā)育而不斷擴(kuò)大并向外伸展，通過(guò)此處外胚層的誘導(dǎo)作用，使眼囊內(nèi)陷而成雙層壁的眼杯。此后又通過(guò)一定的誘導(dǎo)作用形成眼的水晶體原基，直到形成晶體。此時(shí)還可見(jiàn)胚體呈微弱的間歇性顫動(dòng)，肌節(jié)已達(dá)17～18 對(duì)(圖24)。

肌肉效應(yīng)期:受精21h20min 后，胚體開(kāi)始出現(xiàn)間斷性微弱的肌肉收縮，收縮時(shí)從背部肌節(jié)開(kāi)始向尾部傳遞，繼而尾部開(kāi)始擺動(dòng)(圖25)。

心臟出現(xiàn)期:受精后22 h 55 min，耳囊中出現(xiàn)一對(duì)耳石。在脊索前，卵黃囊前上方，有一串細(xì)胞，即為心臟原基，且開(kāi)始跳動(dòng)，胚胎出現(xiàn)血液循環(huán)，血液無(wú)色。肌節(jié)已達(dá)22 對(duì)(圖26)。

出膜期:受精后36h30 min，開(kāi)始出膜，1h50 min 出膜完畢。剛出膜的仔魚(yú)無(wú)色透明，全長(zhǎng)為3.98 ±0.37mm，卵黃囊在魚(yú)體下方呈現(xiàn)前粗后細(xì)的錐體(圖27)。

3 討論

魚(yú)類胚胎發(fā)育速率和出膜率受外界因子影響較大，主要因子有水溫、溶解氧、光照、水質(zhì)以及敵害生物等［14］。魚(yú)類的胚胎發(fā)育都需要一個(gè)適合的水溫范圍，如果超過(guò)或是低于這個(gè)范圍，胚胎發(fā)育將停滯、異?；蚴撬劳觥Ｔ诤线m的水溫范圍內(nèi)，卵的發(fā)育時(shí)間與溫度呈正相關(guān)［15］。魚(yú)卵發(fā)育對(duì)溶解氧要求隨種類，卵的類型和特點(diǎn)而不同，魚(yú)卵所需氧氣是通過(guò)擴(kuò)散得到的，受精卵在不同階段對(duì)需氧量要求也不一樣［16］。薛正楷［17］提出黑尾近紅鲌繁殖產(chǎn)卵最低水溫17℃，最適水溫19～24℃，但沒(méi)有提出產(chǎn)卵繁殖的最高溫度。本研究中胚胎發(fā)育的溫度為26.3～28.5℃，說(shuō)明黑尾近紅鲌胚胎能夠在28.5℃水溫中存活，與張建銘［9］報(bào)道的結(jié)果一致。采用流水孵化的方法給氧，胚胎能正常發(fā)育，說(shuō)明流水能夠滿足黑尾近紅鲌的胚胎發(fā)育耗氧量的需求，這與方耀林［18］等報(bào)道的團(tuán)頭魴胚胎發(fā)育耗氧量的研究一致。

在人工養(yǎng)殖環(huán)境下，水體的理化因子、餌料來(lái)源和營(yíng)養(yǎng)配比的不同對(duì)親魚(yú)產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步對(duì)成熟卵的顏色及卵徑的大小產(chǎn)生影響［19］。劉丹陽(yáng)［20］等曾報(bào)道興凱湖翹嘴紅鲌、太湖翹嘴紅鲌、巢湖翹嘴紅鲌和海南紅鲌的成熟卵的顏色、吸收后卵徑的大小、吸收后卵周隙及受精卵類型非粘性卵存在著差異性，并指出這種差異性是由于生態(tài)差異及生境差異而導(dǎo)致的。本研究中贛南地區(qū)人工養(yǎng)殖黑尾近紅鲌的卵的顏色及卵徑的大小與殷海成等［7］報(bào)道的一致，成熟的黑尾近紅鲌卵呈圓形，比重大于水，強(qiáng)粘性。顏色為淡紅色，透明性卵膜，卵黃呈端粒狀，成熟卵的直接為0.91 ±0.04mm，并沒(méi)有出現(xiàn)因?yàn)榄h(huán)境因素的改變而帶來(lái)成熟卵子生理生化的改變。這也表示著贛南地區(qū)人工養(yǎng)殖的黑尾近紅鲌的性腺發(fā)育良好，從而進(jìn)一步佐證了贛南地區(qū)適合黑尾近紅鲌的人工養(yǎng)殖，這與本項(xiàng)目組先前的報(bào)道一致。

溫度是影響一個(gè)物種胚胎發(fā)育速率的主要環(huán)境因素，一般情況下，同種魚(yú)類的受精卵在不同溫度條件下，胚胎發(fā)育所需的時(shí)間存在一定的差異，通常溫度越高孵化時(shí)間越短［21］。殷海成［7］等報(bào)道黑尾近紅鲌從受精到出膜在24.5℃時(shí)需要約50h;Xiong 等［6］報(bào)道在水溫為25.7～27℃(平均水溫26.5℃)條件下，整個(gè)發(fā)育過(guò)程需要43 h 15 min;而本研究發(fā)現(xiàn)贛南地區(qū)人工養(yǎng)殖黑尾近紅鲌的胚胎在水溫為26.3～28.5℃(平均水溫27.5℃)條件下，整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程需要36h30min，這表明溫度是影響黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育一個(gè)重要的環(huán)境因素，溫度越高所需要的發(fā)育時(shí)間越短，這也與鯉科魚(yú)類發(fā)育特征一致［22］。贛南地區(qū)人工養(yǎng)殖黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育的特征與之前報(bào)道的結(jié)果類似，主要區(qū)別在于胚胎各個(gè)時(shí)期發(fā)育時(shí)間的差異性。由不同溫度下黑尾近紅鲌發(fā)育時(shí)期所需要的時(shí)間(表1)可知:在卵裂期，胚胎在平均水溫27.5℃所需要的時(shí)間與平均水溫24.5℃［7］所需要的時(shí)間基本一致，而在平均水溫26.5℃所需要的時(shí)間比前2個(gè)溫度要短，卵裂期胚胎并沒(méi)有隨著溫度的升高呈下降趨勢(shì)。這與梁正其［23］報(bào)道的普安銀鯽的胚胎隨著溫度的升高，發(fā)育時(shí)間逐漸縮短的結(jié)果不一致。這也表明黑尾近紅鲌的胚胎在發(fā)育早期存在最佳發(fā)育溫度;在胚胎發(fā)育的中晚期，三種溫度下黑尾近紅鲌的發(fā)育的時(shí)間基本上一致;出膜期，平均水溫為24.5℃時(shí)需要25h 才能完成出膜，平均水溫26.5℃時(shí)需要20h 才能完成出膜，平均水溫為27.5℃時(shí)近需14h 就能完成出膜，由此可見(jiàn)溫度對(duì)黑尾近紅鲌出膜期影響非常明顯。據(jù)此可以推測(cè)溫度對(duì)黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育的影響主要是在胚胎發(fā)育的早期與出膜期，這可為黑尾近紅鲌的人工繁殖提供指導(dǎo)。

表1 不同溫度下黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育時(shí)間

圖1-27 不同發(fā)育時(shí)期黑尾近紅鲌的主要形態(tài)特征

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