高 旭 ，鄭永杰 ，譚陽(yáng)陽(yáng)，郭 巖

（1.齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市質(zhì)量檢測(cè)中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.牡丹江出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 牡丹江 157021；4.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

免疫球蛋白（IgG）是一種具有抗體活性的球蛋白。IgG不易被胰蛋白酶水解，可以直接滲透腸壁進(jìn)入血液，因此，IgG對(duì)嬰兒的胃腸道具有保護(hù)作用[1-3]。國(guó)內(nèi)外IgG的檢測(cè)方法有：酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、免疫膠體金法、免疫擴(kuò)散法、免疫比濁法、免疫電泳法、毛細(xì)管電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法等。其中高效液相色譜法具有靈敏度高，分析速度快，檢出限低等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)高效液相色譜測(cè)定嬰幼兒乳制品中免疫球蛋白IgG含量的方法進(jìn)行優(yōu)化。分別對(duì)流速、柱溫、流動(dòng)相的pH值、檢測(cè)波長(zhǎng)等因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的IgG的液相色譜條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

KH2PO4、K2HPO4、甘氨酸、HCl、H3PO4、NaOH、乙腈（色譜純）、乙醇（色譜純）、嬰幼兒乳制品、IgG標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）。

高效液相色譜儀HP1100(美國(guó)安捷倫公司)；Hi-Trap protein GHP色譜柱（1 mL美國(guó)安捷倫公司）；Venusil XBP-NH2氨基柱（5μm，100?，4.6×250mm日本島津GL公司）；Hjchrom Wonbasil C18柱（5μm，4.6×250mm美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 IgG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取25mg IgG標(biāo)準(zhǔn)品，用0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH值為6.5）稀釋到25mL，得到的IgG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1.0mg·mL-1。并用0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH值為6.5） 將其稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理 稱取嬰兒配方奶粉2g，用0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液溶解，渦旋5min，8000r·min-1、4℃下離心30min去除脂肪，取脫脂乳，用乳酸調(diào)pH值至4.6，超聲后8000r·min-1、4℃下離心40min，去除剩余的油脂和蛋白，取上清液，過(guò)0.45μm微孔濾膜待測(cè)。

1.2.3 色譜條件 本實(shí)驗(yàn)分別使用 C18柱、XBP-NH2氨基柱和Hi-Trap protein GHP1mL色譜柱對(duì)IgG進(jìn)行分析。Hjchrom Wonbasil C18柱和Venusil XBP-NH2氨基柱所用流動(dòng)相為0.05mol·L-1、pH值6.5的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和乙腈（95:5）；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫25℃。使用Hi-Trap protein GHP1mL色譜柱分析時(shí)，流動(dòng)相A：0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.7），流動(dòng)相B：0.05mol·L-1甘氨酸鹽緩沖液（pH值2.7）；流速0.4mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫25℃，按表1的梯度條件進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

使用二級(jí)管在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)IgG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全光譜掃描，如圖1所示，免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)品在220nm和280nm處均有強(qiáng)吸收峰，一般物質(zhì)在220nm處都有吸收，干擾較大。因此，確定其檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。

圖1 IgG 標(biāo)準(zhǔn)品掃描光譜圖Fig.1 Scan spectrum diagram of IgG standard product

2.2 色譜柱的選擇

分別用Hjchrom Wonbasil C18柱、Venusil XBPNH2氨基柱及Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱對(duì)IgG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性定量分析，通過(guò)判斷其響應(yīng)值的大小及分離效果，確定最終檢測(cè)所用的分離柱。

用Hjchrom Wonbasil C18柱對(duì)免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，沒(méi)有找到IgG的目標(biāo)峰；用Venusil XBP-NH2氨基柱對(duì)免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行檢測(cè)，雖確定了IgG的目標(biāo)峰，但響應(yīng)值極小，當(dāng)進(jìn)樣濃度為1.0mg·mL-1時(shí)，其響應(yīng)值不足10mAU，并且分離效果也非常不好；而用Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱對(duì)免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其分離效果、色譜峰形及響應(yīng)值均可達(dá)到滿意效果，在此色譜條件下的IgG標(biāo)樣色譜圖見(jiàn)圖2，圖中保留時(shí)間tR=11.352的峰為IgG目標(biāo)峰。因此，選擇Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱為檢測(cè)嬰幼兒乳制品中免疫球蛋白IgG含量的分離柱。

圖2 IgG 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 HPLC of IgG standard product

2.3 流速的選擇

在流速為0.2、0.4、0.6mL·min-1條件下分別對(duì)0.2mg·mL-1IgG標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè)，流速對(duì)峰面積影響見(jiàn)表2。

表2 流速選擇對(duì)峰面積影響Tab.2 Influence of the flow rate selection for peak area

從表2中得出，流速對(duì)峰面積的影響較小，隨著流速的增大峰面積稍有減小的趨勢(shì)，流速?gòu)?.2 mL·min-1變到0.6mL·min-1，峰面積僅減小3.9 mAU。但在色譜分析中，在不超過(guò)柱壓和滿足分離要求的同時(shí)，應(yīng)盡量選擇稍大的流速。此柱所能承受的柱壓上限10bar，當(dāng)流速為0.6mL·min-1時(shí)超過(guò)此柱柱壓上限。因此，選擇0.4mL·min-1作為Hi-Trap protein GHP1mL色譜柱檢測(cè)時(shí)的最佳流速。

2.4 柱溫的選擇

在柱溫為25、30、35、45℃條件下分別對(duì)0.2mg·mL-1IgG標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè)，柱溫對(duì)峰面積影響見(jiàn)表3。

表3 柱溫選擇對(duì)峰面積影響Tab.3 Influence of the column temperature selection for peak area

從表3中得出，當(dāng)柱溫在25～35℃范圍內(nèi)，峰面積隨柱溫的升高稍有增加，但當(dāng)超過(guò)35℃以后，峰面積呈減小趨勢(shì)。主要原因是：當(dāng)溫度超過(guò)35℃以后，純度較高的免疫球蛋白IgG的熱穩(wěn)定性將會(huì)降低，將有少量IgG會(huì)失活，最終導(dǎo)致峰面積減小。在室溫條件下操作就能得到響應(yīng)值較大目標(biāo)峰峰值。因此，選擇25℃作為Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱檢測(cè)時(shí)的最佳柱溫。

2.5 流動(dòng)相p H 值的選擇

Hi-Trap protein G HP 1mL色譜柱的填料為蛋白GSepharose HP，首先固定洗脫液B（0.05mol·L-1甘氨酸鹽緩沖液）pH值，依次調(diào)結(jié)合液A（0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖液）pH值為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9，然后固定結(jié)合液A的pH值，依次調(diào)洗脫液B的pH值為2.1、2.3、2.5、2.7、2.9，分別在設(shè)定條件下對(duì)1.0mg·mL-1IgG標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合液pH值與其峰面積的關(guān)系見(jiàn)表4。洗脫液pH值與其峰面積的關(guān)系見(jiàn)表5。

表4 結(jié)合液pH 值選擇對(duì)峰面積影響Tab.4 Influence of the pH of combined liquid selection for peak area

由表4得出，在pH值為6.7時(shí)，IgG目標(biāo)峰峰面積最大，說(shuō)明其結(jié)合能力最強(qiáng)。主要原因是：當(dāng)洗脫能力相同時(shí)，結(jié)合力越強(qiáng)，結(jié)合的IgG量越多，則洗脫下來(lái)的IgG量就越多，響應(yīng)值越大。因此，選擇pH值為6.7的0.05mol·L-1的磷酸鹽緩沖液為Hi-Trap protein GHP1mL色譜柱的結(jié)合液。

表5 洗脫液pH 值選擇對(duì)峰面積影響Tab.5 Influence of the pH of eluent liquid selection for peak area

由表5得出，在pH值為2.7時(shí)，IgG目標(biāo)峰峰面積最大，說(shuō)明其洗脫能力最強(qiáng)。主要原因是：當(dāng)結(jié)合能力相同時(shí)，結(jié)合的IgG量相同，洗脫力越強(qiáng)，洗脫的IgG量越多，響應(yīng)值越大。因此，選擇pH值為2.7的0.05 mol·L-1甘氨酸鹽緩沖液為Hi-Trap protein GHP1 mL色譜柱的洗脫液。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)免疫球蛋白IgG的高效液相色譜法進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了嬰幼兒乳制品中的IgG提取的前處理方法。實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件中所用的分離柱進(jìn)行了對(duì)比選擇，對(duì)所選用的分離柱的流速、柱溫及流動(dòng)相pH值進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定最佳色譜條件為：Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速0.4mL·min-1，柱溫25℃，結(jié)合液A為pH值為6.7的0.05mol·L-1的磷酸鹽緩沖液，洗脫液B為pH值為2.7的0.05mol·L-1的甘氨酸鹽緩沖液。

［1］鄭崢，馬彥科.牛初乳的開(kāi)發(fā)利用及研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2010，（4）:746-748.

［2］馬艷麗.牛初乳的營(yíng)養(yǎng)保健功能及開(kāi)發(fā)利用［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2011，（8）:182-187.

［3］徐麗.牛初乳中免疫球蛋白的提取與活性保持技術(shù)研究［D］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.1-7.