齊旺梅 海日汗 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 010018

腸道相關淋巴組織由細胞因子以及相關淋巴組織（PP）構成，其中PP也是我們慣稱的派伊爾結。腸道的免疫反應誘導器官派伊爾結(Peyer.s patches,PP)外表的濾泡連接上皮(FAE)具有一些特定的受體可以結合某些細菌[1]。本次實驗主要研究乳酸菌黏附內(nèi)化于派伊爾結性能從而發(fā)揮免疫作用的機制。結果發(fā)現(xiàn)派伊爾結是通過細菌的內(nèi)化吸附能力從而被誘導產(chǎn)生免疫因子發(fā)揮免疫作用的。具體內(nèi)容如下。

1 材料和方法

1.1 材料

FITC(異硫氰酸熒光素)于Am resco采購；OVA（卵清蛋白）于 Hyclone采購；RPM I1640是由GIBCO公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基。用于TNF-A，IL-10，IL-12檢測的試劑為中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司產(chǎn)品。實驗采用的所有菌株均為本實驗室培養(yǎng)。

1.2 方法

（1）培養(yǎng)乳酸菌

將保存在含甘油15%的細菌培養(yǎng)基中的乳酸菌菌株進行活化（使用-70e的瓊脂培養(yǎng)基），之后將其進行單株菌落分離培養(yǎng)在37e的液體培養(yǎng)基內(nèi)17h，進行連續(xù)2次的轉接，使用4800r/m in的離心速度離心10m in，進行菌株的收集。

（2）熒光標記乳酸菌

把活細菌或處理過的細菌懸浮于100 mg Pm LFITC中 (溶解于PBS,pH7.3),37e暗處作用1 h,PBS洗四次,然后把細菌懸浮于PBS(109CFUPm L)[2]。

（3）制備體外派伊爾結

參照原雪琦、常桂芳等[3,4]的制備進行方法總結：把6周齡健康KM種小鼠用乙醚麻醉,脫頸處死,取出小腸,用預冷的PBS（磷酸緩沖液）清洗內(nèi)容物,剪下派伊爾結段組織塊。

（4）測定乳酸菌內(nèi)化黏附于派伊爾結

將被熒光素標記的乳酸菌按照菌株的不同放入96孔板的微孔，每個微孔內(nèi)放入4個派伊爾結組織塊（內(nèi)壁朝上）。于暗處37e的培養(yǎng)基進行1小時的搖床培養(yǎng)。然后使用PBS進行清洗，加入消化液，于70e培養(yǎng)基內(nèi)17小時，待組織塊耗盡，以PBS為空白對照，使用化學發(fā)光或熒光分析儀，分別在530nm發(fā)射光以及485nm激光波長的光下對熒光值進行檢測。內(nèi)化黏附性為每克派伊爾結相對的熒光數(shù)值。

（5）測定細胞因子

按照TNF-A，IL-10，IL-12檢測試劑的說明書進行檢測。每個樣品要重復檢測。

（6）小鼠分組處理

實驗采用的是6周齡的小鼠（KM種），隨機分成6個小組，每組10只。①為空白組：不進行OVA致敏處理，全程使用PBS洗胃。②為致敏空白組：進行OVA致敏處理，全程使用PBS洗胃。③致敏L.rhamnosusGG洗胃組：進行OVA致敏處理，全程使用菌懸溶液洗胃。第④，⑤，⑥三組分別為致敏L.acidophilusFn037 L洗胃組，致敏plantarumFn008 L洗胃組，致敏caseiFn012洗胃組，其操作方法均與第③組相同。在實驗3周后，脫臼處死小鼠，看小鼠糞便形狀，水樣球狀糞便就成功。

（7）測定小鼠腹腔巨噬cell的吞噬活性

在實驗3周后，脫臼處死小鼠，使用PBS溶液取其腹腔滲出液，經(jīng)過與熒光標記以及培養(yǎng)基的培養(yǎng)后，在530nm發(fā)射光以及485nm激光波長的光下，檢測熒光值。

（8）測定小鼠糞便中sIgA

實驗3周后，對每只小鼠進行糞便的新鮮收集并給予稱重，使用PBS稀釋后于溫室培養(yǎng)半個小時，混合離心，按照測定試劑說明書測定小鼠糞便中的sIgA。

（9）統(tǒng)計學方法

所有實驗數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0進行計算處理，并使用方差檢驗。

2 結果

2.1 乳酸菌對派伊爾結的黏附性以及誘導細胞因子的數(shù)量比較

L.caseiFn012，L.plantarum Fn008，L.philusFn 037，L.rhamnosusGG對派伊爾結的內(nèi)化能力依次增強，但對派伊爾結誘導產(chǎn)生IL-12，TNF-A和IL-10的能力相當。

2.2 對腹腔巨噬cell吞噬活性的影響

從結果來看，第②組小鼠腹腔巨噬cell吞噬活性顯著增強，p＜0.05具有統(tǒng)計學意義，第③組進一步顯著上升，p＜0.05具有統(tǒng)計學意義，其它菌株組除了第⑥組與空白組相比較也均有提升，且差異明顯，p＜0.05具有統(tǒng)計學意義，而第⑥組與空白組無明顯差異（p＞0.05）。 具體見表 1。

表1 各組對腹腔巨噬cell吞噬活性的影響比較

2.3 測定小鼠糞便中sIgA致敏可抑制小鼠對sIgA的分泌,乳酸菌則可增強小鼠對sIgA的分泌，第③，④，⑤三組均可削弱由于致敏導致的sIgA分泌下降情況，且效果顯著，p＜0.05（具有統(tǒng)計學意義）。第⑥組菌株無明顯作用，p＞0.05（不具有統(tǒng)計學意義）。詳細見表2。

表2 各組對小鼠分泌sIgA的影響比較

3 結論

筆者通過此次研究得出，派伊爾結是通過細菌菌株的內(nèi)化黏附，被誘導產(chǎn)生免疫細胞因子從而發(fā)揮其在腸道黏膜免疫中的作用，并且免疫因子分泌的多少與細菌菌株的內(nèi)化黏附能力成正比。這可為以后工作中對免疫調節(jié)性乳酸桿菌以及活菌疫苗載體的篩選提供科學依據(jù)。

[1]Brayden DJ,Baird AW.Apical membrane receptors on intes-tinal M cells：potential targets for vaccine delivery [J].AdvDrug Deliv Rev,2004,56(6)：721-726.

[2] Vinderola CG,Medici M,Perdigon G.Relationship betweeninteraction sites in the gut,hydrophobicity, mucosal immuno -modulating capacities and cell wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteria[J].J Appl M icrobiol,2004,96(2)：230-243.

[3]原雪琦,孫進,常桂芳,樂國偉,施用暉.10株乳酸菌黏附小鼠派伊爾結及免疫調節(jié)作用研究[J].中國微生態(tài)學雜志，2009，21(7)：577-580.

[4]常桂芳，施用暉，樂國鋒，孫進，徐子偉，原雪琪，胡曉麗.乳酸菌內(nèi)化小鼠小腸派伊爾結特性及其影響因素[J].科技導報，2008，26（23）：65-69.