李德山,曹榮邱,高華山,任桂萍,劉明瑤
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030)
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF),家族共有22名成員,分別通過(guò)與細(xì)胞膜上四種FGF受體(FGFR)結(jié)合,激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路而起到各自生物學(xué)作用。FGF家族成員為150~300個(gè)氨基酸組成的多肽,成員間同源性約為30%~60%[1]。FGF21是FGF19亞家族新成員,最早由Nishimura等發(fā)現(xiàn),肝臟[1]、脂肪[3]和骨骼肌[4]為主要表達(dá)器官或組織[2]。FGF21由于其獨(dú)特代謝調(diào)節(jié)功能,一直是代謝疾病研究熱點(diǎn),其功能主要表現(xiàn)在能促進(jìn)脂肪細(xì)胞糖吸收[5],研究表明FGF21可不依賴胰島素降低血糖。FGF21可改善胰島β細(xì)胞功能,促進(jìn)胰島素分泌,增強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性。嚙齒類動(dòng)物及靈長(zhǎng)類動(dòng)物2型糖尿病模型和飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型上研究[6-7]表明,F(xiàn)GF21可降低血糖及甘油三酯水平,增加脂肪消耗并抑制脂肪合成,逆轉(zhuǎn)肝脂肪變性及胰島素抵抗,并能起到減肥作用。FGF21在治療代謝疾病特別是糖尿病方面具有廣闊市場(chǎng)前景。研究發(fā)現(xiàn)FGF21在大腸桿菌中表達(dá)量低且主要以包涵體形式表達(dá),嚴(yán)重制約FGF21成藥可能性[8-9]。
任何一種具有應(yīng)用價(jià)值蛋白質(zhì)和多肽可通過(guò)蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造以提高其活性、特異性和穩(wěn)定性,降低免疫原性和毒副反應(yīng),延長(zhǎng)在體內(nèi)半衰期等。何昆等在FGF21C端添加兩個(gè)精氨酸提高FGF蛋白穩(wěn)定性和表達(dá)量,而國(guó)內(nèi)外研究運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)FGF21進(jìn)行改造的文獻(xiàn)很少[10]。
本研究對(duì)比FGF21及FGF家族其他成員氨基酸序列,根據(jù)FGF21與同源序列差異,用基因突變方法,對(duì)FGF21氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建mutFGF21基因,成功實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中高水平可溶性表達(dá),并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行驗(yàn)證。
表達(dá)載體pSUMO-FGF21及表達(dá)菌株、擴(kuò)增用大腸桿菌DH5α及表達(dá)用菌Rosetta(DE3)均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心生物制藥實(shí)驗(yàn)室保存;PCR克隆產(chǎn)物擴(kuò)增載體pMD18-T vector購(gòu)自TAKARA公司。
DpnI, Primer Star DNA polymerase, dNTP Mixture,IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(均購(gòu)自TAKARA公司);AxyPrep質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒,AxyPrep DNA膠回收試劑盒,AxyPrep PCR清潔試劑盒(均購(gòu)自Axygen公司);填料Ni Sepha?rose 6 Fast Flow及預(yù)裝柱HiPrepTM 26/10 Desalting(均購(gòu)自GE公司);高糖DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)、新生牛血清(NCS)(均購(gòu)自Invitrogen Corporation公司);Insulin和牛血清白蛋白(均購(gòu)自Sigma公司),葡萄糖檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自四川邁克科技有限責(zé)任公司);SUMO蛋白酶、兔抗人FGF21多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(羊抗兔IgG)(購(gòu)自Santa Cruz Bio?technology);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
FGF1(UniProtKB/Swiss-Prot:P05230.1),F(xiàn)GF2(UniProtKB/Swiss-Prot:P09038),F(xiàn)GF4(UniProtKB/Swiss-Prot:P08620.1), FGF10(UniProtKB/Swiss-Prot:O15520.1),FGF17(UniProtKB/Swiss-Prot:O602 58),FGF19(UniProtKB/Swiss-Prot:O95750),FGF21(UniProtKB/Swiss-Prot:Q9NSA1)及 FGF23(UniProt KB/Swiss-Prot:9GZV9)序列檢索自UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)。序列比對(duì)采用DNAMAN軟件。
通過(guò)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn),F(xiàn)GF21第141位氨基酸為G,是一個(gè)親水極性氨基酸;而該位點(diǎn)FGF家族其他成員保守氨基酸為F或M,是疏水非極性氨基酸。本試驗(yàn)將G變成F,使FGF21在表達(dá)時(shí)更易形成疏水核心,蛋白結(jié)構(gòu)更緊密,提高其在大腸桿菌中穩(wěn)定性,從而增加FGF21產(chǎn)量。
采用生物信息軟件DNASTAR對(duì)mutFGF21和hFGF21氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),二者預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)hFGF21基因序列在突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)引物:Forward:5'CTCGCTTCC TGCCACTACCATTCCTGCCCCCCGCACTCCCG 3',Reverse:5'CGGGAGTGCGGGGGG CAGGAATGG?TAGTGGCAGGAAGCGAG 3',下劃線部分為突變位置。采用定點(diǎn)突變方法PCR(Polymerase Chain Reaction,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增環(huán)狀pSUMO-FGF21表達(dá)載體。PCR純化產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ核酸內(nèi)切酶酶切,消化掉模板鏈。取5 μL酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌,涂布于含100 μg·mL-1Amp抗性LB固體培養(yǎng)基平板上,37℃培養(yǎng)12~16 h。隨機(jī)挑取單菌落,接種于含100 μg·mL-1AmpLB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜,提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒樣品由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
鑒定正確pSUMO-mutFGF21轉(zhuǎn)化Rosetta表達(dá)菌,培養(yǎng)過(guò)夜,挑取單菌落接種于含100 μg·mL-1AmpLB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取上述過(guò)夜培養(yǎng)菌液以1%比例接種于含100 μg·mL-1Am?pLB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2~3 h,當(dāng)OD600至 0.4~0.6時(shí),加 IPTG 至終濃度 0.25 mmol·L-1,37℃繼續(xù)培養(yǎng),每隔1 h取1 mL菌液4℃?zhèn)溆?。收集菌體用PBS重懸,超聲破碎進(jìn)行SDS-PAGE分析mutFGF21融合蛋白表達(dá)量與時(shí)間關(guān)系。對(duì)照組為不加IPTG培養(yǎng)3 h菌體。
mutFGF21表達(dá)菌37℃搖瓶培養(yǎng)3 h后加入IPTG至終濃度0.25 mmol·L-1,誘導(dǎo)3 h收集菌體,破碎后菌體離心取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白包涵體情況。mutFGF21和hFGF21表達(dá)菌37℃搖瓶培養(yǎng)至OD為0.4,加入終濃度為0.25 mmol·L-1IPTG繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)3 h,取1 mL菌液收集菌體,超聲破碎后離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE,上樣量均為40 mL。
表達(dá)菌株擴(kuò)大培養(yǎng),收集菌體超聲波破碎后,2 000 g,40 min離心收集上清。運(yùn)用AKTA purifier 100純化系統(tǒng),收集上清經(jīng)HisTrapTM FF crude親和層析柱純化SUMO-mutFGF21融合蛋白,用HiPrepTM 26/10 Desalting柱脫鹽后加入SUMO蛋白酶,將SUMO標(biāo)簽切除。酶切后經(jīng)HisTrapTM FF crude親和層析純化mutFGF21成熟蛋白。SDSPAGE分析蛋白純化情況。
將純化后mutFGF21蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜進(jìn)行Western blot;5%脫脂奶粉封閉1 h,兔抗人FGF21多克隆抗體為一抗(1∶500稀釋)孵育過(guò)夜,洗滌,羊抗兔HRP標(biāo)記IgG抗體為二抗(1∶7 500稀釋)孵育1 h,洗滌,加入化學(xué)發(fā)光底物Super Signal檢測(cè)試劑(Pierce)后,暗室X光片暗匣曝光、顯影。
取生長(zhǎng)狀態(tài)良好HepG2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化液消化,離心收集細(xì)胞,按照2.5×104密度將細(xì)胞接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)液為200 μL·孔-1。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成均勻單層時(shí),把原培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h后,分別加入濃度分別為0.2,2,20 mg·L-1FGF21成熟蛋白和mutFGF21成熟蛋白200 μL,每個(gè)處理重復(fù)3次,24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液2 mL用GOD-POD法檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖含量[11],用Excel軟件分析試驗(yàn)結(jié)果,組間比較采用t檢驗(yàn)。
培養(yǎng)基中殘留葡萄糖含量計(jì)算公式為:
葡萄糖濃度(mmol·L-1)=OD樣品/OD標(biāo)準(zhǔn)×5.55 mmol·L-1
計(jì)算葡萄糖消耗率公式為:
葡萄糖消耗率(%)=[(C空白葡萄糖-C給藥葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100%。
采用DNASTAR軟件對(duì)mutFGF21和野生型FGF21氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),所用方法為Garnier-Robson Method。二者預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1所示。比較發(fā)現(xiàn)氨基酸序列從140位至158位除α螺旋外二級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化(兩豎線間區(qū)域所示),與此同時(shí),其他部位均未發(fā)生改變。變化主要有β折疊、轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲位置變化、增加一個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲及柔性區(qū)域減少等。
采用定向突變方法擴(kuò)增環(huán)狀pSUMO-FGF21表達(dá)載體,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,純化PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI核酸內(nèi)切酶酶切,消化掉模板鏈,酶切產(chǎn)物取樣轉(zhuǎn)化DH5α,挑單菌落提質(zhì)粒鑒定測(cè)序,測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)第421和422位核苷酸GG突變?yōu)門T,相應(yīng)氨基酸序列第141位G突變?yōu)镕,與試驗(yàn)設(shè)計(jì)一致。
圖1 hFGF21和mutFGF21二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果比較Fig.1 Comparison of secondary structure prediction results of hFGF21 and mutFGF21
將陽(yáng)性菌在37℃,0.25 mmol·L-1IPTG條件下,誘導(dǎo)培養(yǎng),SUMO-mutFGF21表達(dá)菌株誘導(dǎo)3 h后菌體經(jīng)超聲破碎離心后,分別取沉淀和上清進(jìn)行電泳,結(jié)果分析表明融合蛋白大部分以可溶形式存在,見(jiàn)圖2。
圖2 SUMO-mutFGF21融合蛋白可溶性分析Fig.2 Analysis of the portion of soluble SUMO-mutFGF21 fusion protein
mutFGF21和hFGF21表達(dá)菌株37℃均培養(yǎng)至OD為0.4,加入相同濃度IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)3 h,然后取相同濕重菌體,用等體積PBS重懸后超聲破碎,進(jìn)行SDS-PAGE,上樣量均為40 mL。結(jié)果見(jiàn)圖3,灰度值分析顯示mutFGF21蛋白產(chǎn)量比hFGF21提高50%。
圖3 hFGF21和mutFGF21產(chǎn)量比較Fig.3 Yield comparison of hFGF21 and mutFGF21
大量培養(yǎng)后收集菌體經(jīng)超聲破碎后,12 000 g,離心30 min,收集菌體,超聲破碎后取上清。上清通過(guò)AKTApurifier 100系統(tǒng)經(jīng)過(guò)HisTrapTMFF crude親和層析,用Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰,得到純度較高融合蛋白。融合蛋白通過(guò)HiPrepTM26/10 Desalting柱buffer置換,加入SUMO蛋白酶進(jìn)行酶切。酶切后產(chǎn)物,經(jīng)HisTrapTM FF crude親和層析,收集流穿峰,15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化情況。表明經(jīng)過(guò)兩次親和層析,得到mutFGF21其分子質(zhì)量為20 ku,與mutFGF21蛋白理論值19.4 ku相差不大。見(jiàn)圖4。
純化后成熟mutFGF21蛋白經(jīng)Western blot檢測(cè)證明,1號(hào)泳道m(xù)utFGF21能與兔抗hFGF21抗體發(fā)生特異性反應(yīng)(見(jiàn)圖5)。
用不同濃度mutFGF21和hFGF21蛋白分別處理HepG2細(xì)胞24 h后,與對(duì)照相比,兩種蛋白處理HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗率顯著增加,并且隨著蛋白濃度增加而增加,呈劑量依賴關(guān)系。說(shuō)明mut?FGF21蛋白同hFGF21蛋白一樣具有調(diào)節(jié)細(xì)胞葡萄糖代謝作用;另外,mutFGF21細(xì)胞活性與hFGF21相比,略有提高,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如圖6所示。
圖6 mutFGF21和hFGF21糖吸收活性比較Fig.6 Comparison of glucose uptake efficiency in of mutFGF21 and hFGF21 protein
FGF21是一類重要糖脂代謝調(diào)節(jié)因子,可有效調(diào)節(jié)血液中葡萄糖和甘油三脂水平,抑制肝臟生酮作用,改善脂譜。FGF21作為潛在糖尿病治療藥物,不會(huì)像FGF1、FGF2等誘發(fā)癌癥,與傳統(tǒng)藥物胰島素相比,具有療效持久、無(wú)低血糖、無(wú)體重增加等優(yōu)勢(shì)。FGF21目前主要以大腸桿菌為宿主生產(chǎn),但產(chǎn)量較低。因此急需通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段對(duì)FGF21進(jìn)行改造,提高其表達(dá)量。
蛋白質(zhì)工程改造蛋白首先是靶位點(diǎn)選擇,分子設(shè)計(jì)不精確性、盲目性使被改進(jìn)實(shí)用蛋白質(zhì)不多,多數(shù)成果集中于理論和技術(shù)。本研究通過(guò)FGF21與FGF家族其他成員間氨基酸序列比對(duì),從同源序列差異入手進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),獲得較好結(jié)果。從這一出發(fā)點(diǎn)改造FGF21,有利于了解其對(duì)空間結(jié)構(gòu)和生物活性影響。
FGF家族成員間氨基酸序列同源性約為30%~60%,其中高度保守氨基酸序列對(duì)蛋白質(zhì)功能影響較大,其中核心區(qū)第5個(gè)氨基酸Y,第84個(gè)氨基酸Y,第121位氨基酸L,對(duì)蛋白質(zhì)功能影響最大,這在FGF4突變中已得到證實(shí)。通過(guò)對(duì)比FGF1-FGFR1、FGF2-FGFR1、FGF2-FGFR2晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),F(xiàn)GFR與FGF結(jié)合位點(diǎn)在D2(FGFRIg樣結(jié)構(gòu)域2)和D2-D3linker區(qū)域。通過(guò)重疊FGF4晶體結(jié)構(gòu)到FGF2-FGFR1結(jié)構(gòu)上,得到一個(gè)FGF4-FGFR1模型,在FGF4-D2表面,發(fā)現(xiàn)FGF4上87位Y、166位Y,203位L被FGFR1D2上幾個(gè)疏水氨基酸包圍[12]。為驗(yàn)證這種相互作用的正確性,Bellostap等突變FGF4 87位Y、166位Y,203位L為A,發(fā)現(xiàn)FGF4在受體親和力,以及促進(jìn)DNA合成方面都降低超過(guò)100倍,驗(yàn)證結(jié)構(gòu)正確性[13]。因此,推斷FGF家族中保守氨基酸序列發(fā)生變化將對(duì)功能產(chǎn)生影響。通過(guò)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)FGF家族中一個(gè)保守區(qū)域內(nèi)其中一個(gè)氨基酸與FGF21不同,因此通過(guò)定點(diǎn)突變?cè)摪被嵋匝芯科鋵?duì)FGF21表達(dá)量影響。
FGF家族成員具有120個(gè)氨基酸構(gòu)成11(內(nèi)分泌FGFs)或12(旁分泌FGFs)個(gè)β片層結(jié)構(gòu)組成“β-trefoil”結(jié)構(gòu),這一保守區(qū)側(cè)翼連接不同N端和C端賦予FGF家族成員特異生物活性[13]。該核心結(jié)構(gòu)決定于18個(gè)大疏水殘基,與蛋白穩(wěn)定性有關(guān)。與FGF21一樣,F(xiàn)GF1存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短問(wèn)題,Brych等在FGF1該同源區(qū)內(nèi)進(jìn)行定點(diǎn)突變,得到穩(wěn)定性增加FGF1突變蛋白[14]。本試驗(yàn)所嘗試突變位點(diǎn)位于該保守結(jié)構(gòu)內(nèi),把G突變?yōu)镕,增加核心結(jié)構(gòu)疏水性,使多肽在折疊時(shí)更易形成疏水核心,減少不穩(wěn)定蛋白產(chǎn)生,同時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)更緊密,減少降解。是突變提高FGF21表達(dá)量重要原因。突變蛋白穩(wěn)定性還需進(jìn)一步研究。
本研究通過(guò)比較FGF21氨基酸序列和FGF家族保守序列,根據(jù)二者間差異,設(shè)計(jì)mutFGF21基因,使用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)突變蛋白結(jié)構(gòu)變化,提供理論依據(jù)。使用基于PCR定點(diǎn)突變方法,進(jìn)行一步PCR得到mutFGF21表達(dá)載體并在大腸桿菌中成功表達(dá)突變蛋白。結(jié)果表明,mutFGF21蛋白大部分以可溶性形式表達(dá),表達(dá)量與hFGF21相比提高50%,HepG2細(xì)胞糖吸收試驗(yàn)表明突變蛋白具有促進(jìn)糖吸收功能,且與hFGF21相比略有提高。綜上所述,對(duì)FGF21改造,即第141位G突變?yōu)镕,在不改變hFGF21細(xì)胞活性基礎(chǔ)上提高FGF21表達(dá)量,為FGF21后續(xù)研究及產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。
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