劉立新，高月林，王朝興，張羽男

（1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

隨著抗生素被大量使用，耐藥菌感染已成為21世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨重大挑戰(zhàn)。近年來(lái)，臨床分離葡萄球菌中耐甲氧西林菌株（MRSA）檢出率越來(lái)越高，許多地區(qū)報(bào)道已超過(guò)80%，MRSA已成為感染重要病原菌，一旦發(fā)生流行，傳播迅速，難以控制[1]。因此，研制新抗菌藥物和逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性新型藥物制劑成為藥學(xué)研究領(lǐng)域亟待解決難題之一。

β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是MRSA獲得耐藥性機(jī)制之一，這種酶可抵抗具有β-內(nèi)酞胺環(huán)抗生素。研究發(fā)現(xiàn)[2]，含有黃酮類化合物中藥如黃連、柴胡、苦參、黃芪、野菊花等，與抗生素聯(lián)合應(yīng)用能增加耐藥菌對(duì)藥物敏感性。本試驗(yàn)針對(duì)金黃葡萄球菌耐藥性，應(yīng)用體外抑菌試驗(yàn)篩選對(duì)MRSA有抑制作用黃酮類化合物，通過(guò)測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶活性來(lái)探討黃酮類化合物逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性機(jī)制，為研發(fā)新型細(xì)菌耐藥抑制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

耐甲氧西林金黃葡萄球菌菌株由佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供。

1.1.2 藥物

蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素（均購(gòu)自南京青澤醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；黃連、柴胡、連翹等黃酮類化合物提取物（由佳木斯大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）；頭孢他啶（購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠）；克拉維酸（購(gòu)自北京華業(yè)寰宇化工有限公司）。

1.1.3 試劑

蛋白胨、水解酪蛋白、牛肉浸膏、胰蛋白胨（均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司）。

1.1.4 儀器

SW-CJ-2DD單人雙面凈化工作臺(tái)（購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司）；PYX-DH450電熱恒溫培養(yǎng)箱（購(gòu)自上海璽恒實(shí)業(yè)有限公司）；Sunrise酶標(biāo)儀（購(gòu)自帝肯公司）。

1.2 方法

1.2.1 耐藥菌株鑒定

1.2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

將供試菌從平板培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落接種于2 mL MH培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)16～18 h，參照比濁管使其生長(zhǎng)濁度達(dá)9×108個(gè)·mL-1。放入4℃冰箱備用。

1.2.1.2 MRSA鑒定[3]

將供試菌接種到M-H瓊脂平板上，再貼上1 μg苯唑青霉素紙片，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，抑菌環(huán)直徑≥13 mm為敏感菌，≤10 mm為耐藥菌。

1.2.1.3 生物學(xué)鑒定

按全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)耐藥性試驗(yàn)

1.2.2.1 最低抑菌濃度（MIC值）測(cè)定

采用試管二倍稀釋法，將耐藥菌液用MH培養(yǎng)液作1∶1 000稀釋，將蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素分別配置成濃度為1 mg·mL-1藥液，將黃連、柴胡、連翹中提取黃酮類化合物配置成濃度為2 mg·mL-1藥液，分別取7支試管，用菌液倍倍稀釋，37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)最低濃度為最低抑菌濃度。

1.2.2.2 藥敏試驗(yàn)

將各種黃酮類化合物配制成低于最低抑菌濃度藥液，挑取耐藥性金黃葡萄球菌于各藥液中，37℃恒溫培養(yǎng)時(shí)間24 h后，接種于平板培養(yǎng)基上使其生長(zhǎng)。挑取生長(zhǎng)良好單個(gè)菌落制成菌液，用無(wú)菌棉簽均勻地涂布在M-H培養(yǎng)基上，待菌液稍干貼上苯唑青霉素藥敏紙片，同時(shí)用不經(jīng)逆轉(zhuǎn)耐藥金黃葡萄球菌作為陰性對(duì)照，經(jīng)克拉維酸逆轉(zhuǎn)作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3β-內(nèi)酰胺酶提取[4]

將耐藥金黃葡萄球菌接種于各種黃酮類化合物中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，4℃ 10 000 r·min-1離心10 min。沉淀用PBS洗滌兩次后，在-20～37℃反復(fù)凍融6次，4℃13 000 r·min-1離心60 min。留取上清液，為粗酶提取液，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.4β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定[5]

頭孢他啶是β-內(nèi)酰胺酶最佳底物之一，β-內(nèi)酰胺酶活性單位用每mg蛋白在37℃，pH=7.0時(shí)每分鐘能水解底物毫克數(shù)表示。以100 mg·mL-1頭孢他啶為底物，在96孔板中加入0.20 mL PBS緩沖液，0.06 mL頭孢他啶，0.04 mL酶提取液，在波長(zhǎng)482 nm處進(jìn)行時(shí)間掃描，根據(jù)OD值變化求酶活性。

1.2.5 對(duì)照試驗(yàn)

選用克拉維酸作為陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，選用不經(jīng)逆轉(zhuǎn)處理菌株作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥菌株鑒定

供試菌再貼上1 μg苯唑青霉素紙片，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，其抑菌環(huán)直徑為8.9 mm，生物學(xué)鑒定血漿凝固酶陽(yáng)性，V-P陽(yáng)性，麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸，DNA酶陽(yáng)性。鑒定結(jié)果為MRSA菌株[6]。

2.2 MIC值測(cè)定結(jié)果

各種黃酮類化合物對(duì)耐藥金黃葡萄球菌最小抑菌濃度結(jié)果如表1。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將各黃酮類化合物配制成低于MIC值濃度，分別為：蘆丁0.2 mg·mL-1，姜黃素0.2 mg·mL-1，槲皮素0.45 mg·mL-1，木犀草素0.45 mg·mL-1，黃連中黃酮類化合物0.6 mg·mL-1，柴胡中黃酮類化合物1.2 mg·mL-1，連翹中黃酮類化合物1.2 mg·mL-1，分別和耐藥金黃葡萄球菌作用一段時(shí)間后藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2。

由表2可見(jiàn)蘆丁、姜黃素和槲皮素組與陰性對(duì)照組相比抑菌環(huán)直徑差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性效果較好；與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）；與其他各黃酮類化合物組別效果不顯著（P＞0.05）。

表1 黃酮類化合物MIC值Table 1 MIC value of flavonoids compounds

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Medicine sensitive experiment results

2.4 β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可選取蘆丁、姜黃素和槲皮素用于逆轉(zhuǎn)耐藥金黃葡萄球菌試驗(yàn)，提取β-內(nèi)酰胺酶，測(cè)定酶活性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定結(jié)果Table 3 Detection results of β-lactamase activity

由表3可見(jiàn)，經(jīng)蘆丁、姜黃素和槲皮素培養(yǎng)耐藥金黃葡萄球菌β-內(nèi)酰胺酶活性降低，與陰性對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）；蘆丁、姜黃素和槲皮素各組間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

據(jù)報(bào)道MRSA由于其致病性強(qiáng)，己成為臨床抗菌感染治療難題之一，與艾滋病、乙型肝炎并列為世界三大嚴(yán)重感染性疾患[7]。目前，萬(wàn)古霉素是治療MRSA感染最后一道防線，但臨床上己發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌[8]。研究低毒、有效耐藥性抑制劑已在國(guó)際上引起廣泛關(guān)注。由于中藥具有無(wú)殘留、作用靶位多、有效成分多、作用范圍廣及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此從中藥中篩選耐藥抑制劑成為極具前景的研究方向，為解決細(xì)菌耐藥性難題開(kāi)辟捷徑。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于耐藥金黃葡萄球菌中藥耐藥抑制劑研究報(bào)道主要集中于單方中藥和復(fù)方中藥制劑上，而對(duì)于中藥有效成分逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性機(jī)制方面報(bào)道較少。

本試驗(yàn)選取中草藥中普遍含有有效成分-黃酮類化合物為研究對(duì)象，其中包括純黃酮化合物，如蘆丁、姜黃素、槲皮素等；也包括不純黃酮類化合物提取物，如黃連中黃酮類化合物和柴胡中黃酮類化合物等。研究發(fā)現(xiàn)將耐藥金黃葡萄球菌分別接種于含以上黃酮類化合物培養(yǎng)液中作用一段時(shí)間后，金黃葡萄球菌恢復(fù)對(duì)抗生物敏感性，尤其以蘆丁、槲皮素和木犀草素效果明顯，而黃連和柴胡中黃酮類化合物效果不明顯。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明黃酮類化合物能逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性，純黃酮類化合物逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性效果比粗提黃酮類化合物效果顯著。

β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性機(jī)制之一，其能將β-內(nèi)酰胺類抗生素水解成無(wú)抑菌活性產(chǎn)物，使細(xì)菌獲耐藥性[9]。部分中藥對(duì)目前臨床上產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶菌株具有逆轉(zhuǎn)耐藥性作用。黃通旺等應(yīng)用分光光度法測(cè)定大蒜、石芽茶等中草藥提取液對(duì)耐青霉素細(xì)菌所產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶抑制作用[10]。結(jié)果表明，大蒜、黃柏提取液對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有不同程度抑制作用。三黃湯、黃連解毒湯、五味消毒飲對(duì)產(chǎn)酶大腸桿菌逆轉(zhuǎn)機(jī)制也是通過(guò)抑制ESBLs活性和表達(dá)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)效果[11]。何明等研究發(fā)現(xiàn)，肉湯菌經(jīng)雙黃連以及清開(kāi)靈作用后細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶活性都降低[12]。本試驗(yàn)選取藥敏試驗(yàn)結(jié)果較好黃酮化合物蘆丁、姜黃素和槲皮素進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶活性研究，結(jié)果表明，將耐藥金黃葡萄球菌分別接種于含三種黃酮化合物培養(yǎng)液中作用一段時(shí)間后，β-內(nèi)酰胺酶活性降低，根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定結(jié)果，說(shuō)明黃酮類化合物能抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，闡明黃酮類化合物逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性機(jī)制。

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