趙曉妮 孫鳳陽 尹 靜 由香玲

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

龍牙楤木(Aralia elata(Miq.)Seem.)，又名遼東楤木、刺老芽等，屬五加科楤木屬(Aralia L.)植物［1］，為重要的食、藥兼用的植物。其嫩芽含有人體必需的多種氨基酸和微量元素［2］，根皮和樹皮性味辛苦，有小毒，具有補氣安神、強精滋腎、祛風活血、除濕止痛的功效［3］。近年來的研究顯示龍牙楤木皂苷在免疫調節(jié)、腫瘤防治方面有很顯著的作用［4］。但是，龍牙楤木的野生資源由于破壞性、掠奪性地進行連年多茬采收，其資源量急劇下降，黑龍江省已將其列為瀕危珍稀植物，其高效繁殖也顯得尤為重要而迫切。

體胚發(fā)生方式是一種高效快繁方法。關于龍牙楤木體胚發(fā)生的研究報道已有不少，例如:Amemiya et al.［5］利用10年生龍牙楤木樹上的冬芽在含有2，4－D 的 MS 培養(yǎng)基中誘導產生了體胚;Kang et al.［6］在含2，4－D的培養(yǎng)基中，從龍牙楤木毛狀根中誘導了體胚;Dai et al.［7］利用IBA誘導了體細胞胚發(fā)生等。現(xiàn)報道的研究主要是外植體選擇和利用植物生長調節(jié)劑建立體胚快速繁殖體系。在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫能夠誘導龍牙楤木次生體胚發(fā)生。高溫誘導體胚發(fā)生的實例有胡蘿卜和油菜，其中，37℃高溫處理胡蘿卜的頂芽后轉入無任何植物生長調節(jié)劑培養(yǎng)基中誘導了體胚發(fā)生［8］;油菜花芽內小孢子經高溫處理后，誘導了前期體胚［9］。但研究者們未深入分析其中的原因，僅從體胚發(fā)生角度研究了這種誘導體胚發(fā)生的方法。事實上，高溫脅迫會使外植體各種生理狀態(tài)發(fā)生變化，其中一項重要的生理變化是抗氧化酶的變化。因為脅迫產生了大量的活性氧，可使細胞膜脂過氧化而傷害細胞［10］。文中詳細介紹了37℃高溫誘導次生體胚的過程，為高效快速繁殖龍牙楤木提供更簡便快捷的方法;同時考察了高溫處理過程中及次生體胚發(fā)生過程中3種抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)活性的變化特征，從生理活性角度揭示了高溫脅迫處理對體胚誘導的作用。

1 材料與方法

次生體胚誘導:本試驗在先前的研究中，通過無菌實生苗根誘導(在1/2SH+2.0 mg·L－1IBA+20 g·L－1蔗糖的固體培養(yǎng)條件下)獲得了大量龍牙楤木成熟子葉體胚［7］。從中選取1.5 cm長的成熟子葉體胚，接種于不含有任何植物生長調節(jié)劑，添加20 g·L－1蔗糖的WPM固體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)0～3 d，取出放置于培養(yǎng)室進行暗培養(yǎng)誘導次生體胚。每個培養(yǎng)瓶中接種8個體細胞胚，每個處理接種10瓶。每次取0.2 g，每隔5 d取樣1次，共取5次，迅速放入冰箱－40℃保存，留作抗氧化酶活性分析。上述培養(yǎng)基均添加3 g·L－1水晶洋菜(gelrite，Duchefa－Postubus Haarlem，Netherlands)，pH 值為5.8，經過高溫高壓滅菌(121 ℃、0.152 MPa、15 min)后使用。材料在常規(guī)組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)(溫度(23±1)℃，暗培養(yǎng)，濕度60% ～70%)。

SOD、POD、CAT活性測定:將龍牙楤木體胚材料置于預冷的研缽中，加1.0 mL預冷的0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值為7.8)在冰浴上研磨成漿后，轉入離心管中加0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值為7.8)使終體積為 5.0 mL。然后在 4 ℃、10 000 r·min－1離心15 min，取上清液作為粗酶液于冰箱中4℃冷藏，用于測定超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性分析。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光還原法測定［11］;過氧化物酶(POD)活性采用0.3%愈創(chuàng)木酚法［11］測定;過氧化氫酶(CAT)活性采用240 nm比色法［11］測定。

數(shù)據分析:數(shù)據采用Excel 2003進行整理及作圖處理，應用SPSS19.0軟件進行Tukey多重比較分析和相關性分析，所得數(shù)據均為3次的平均值。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫誘導龍牙楤木次生體細胞胚發(fā)生

龍牙楤木成熟體細胞胚在恒溫培養(yǎng)箱中37℃處理0～3 d，接種于無任何植物生長調節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d，都有次生體細胞胚發(fā)生(圖1A、B、C)。觀察發(fā)現(xiàn)，在此過程中10～15 d是次生體細胞胚發(fā)生的時期，此后20～25 d基本是體細胞胚發(fā)育成長的時期。與未進行高溫處理的對照和處理1 d的外植體相比，高溫處理3 d的外植體材料變褐，且平均每個體胚上產生次生體細胞胚的數(shù)量較少，約2個(表1)。統(tǒng)計次生體胚的誘導情況(表1)顯示，高溫處理外植體1 d，次生體胚的誘導情況較好，誘導率和體胚誘導數(shù)量分別為58%和4個，顯著高于對照(P＜0.05);但是隨著高溫處理時間的延長，體胚的誘導率逐漸下降，均顯著低于對照(P＜0.05)，而且高溫處理3d的體胚誘導率略低于處理2 d的，無顯著差異(P＞0.05)。結果表明，合適的高溫脅迫有利于次生體胚發(fā)生。

圖1 成熟體胚經高溫處理后在無任何植物生長調節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中誘導的次生體胚

表1 高溫處理0～3 d的體細胞胚在無任何植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中誘導次生體細胞胚的情況

2.2 高溫脅迫誘導龍牙楤木次生體胚發(fā)生過程中抗氧化酶活性分析

2.2.1 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中SOD活性變化

經高溫處理1～3 d的龍牙楤木體胚與未處理的相比，SOD活性都有所升高，但是升高幅度不大(取材時間為0 d)(表2)。在體細胞胚發(fā)生過程中，與對照相比，在第5 d SOD活性都有所下降，到第10 d時，SOD活性達到最高峰，之后各處理的SOD活性呈下降趨勢。第10～15 d是胚性細胞形成時期。在第5～10 d，未處理材料中的SOD活性都高于處理的;而在第15 d處理材料的SOD活性都高于未處理的。且整個次生體胚發(fā)生過程中，處理1 d外植體中SOD的活性均較高。

2.2.2 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中POD活性變化

龍牙楤木體胚經高溫處理后，與對照相比，各個處理的POD活性均下降(取材時間為0～5 d)(表2)。處理后在次生體胚發(fā)生過程中，胚性細胞的形成時期，即第10 d POD活性迅速上升至最高，而且高溫處理1 d的POD活性最高，隨后其活性下降，且活性基本不變。表明POD活性升高可促進次生體胚發(fā)生和胚性細胞的早期發(fā)育，而高溫脅迫1 d更利于體胚發(fā)生的形成。

表2 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中SOD、POD、CAT活性變化

2.2.3 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中CAT活性變化

龍牙楤木體胚經高溫處理后，與對照相比，各處理的CAT活性均呈下降趨勢(取材時間為0 d)(表2)。在次生體胚發(fā)生過程中，CAT活性逐漸升高，在第15 d CAT活性達到最高，而后其活性雖有小幅下降，但維持在一個較高的水平。高溫處理1 d外植體的CAT活性相對其他處理的較高，而且在次生胚性細胞形成期第15 d活性達到最高，其后維持在較高水平。由此可知次生體胚的發(fā)生發(fā)育過程中，CAT活性均升高。崔凱榮等［12］在研究枸杞的體胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，CAT在繼代愈傷組織中的活性很高，隨著胚性細胞的形成酶活性降低，到分化培養(yǎng)3 d時出現(xiàn)酶活性的低谷，隨著胚性細胞的分裂、發(fā)育，這種酶活性又開始逐漸升高，成熟胚期活性升到和繼代愈傷組織大致相同水平。而與本研究體胚發(fā)生過程不太一致?？赡苡捎诒狙芯客庵搀w材料預先進行的高溫脅迫改變了其變化趨勢。

通過對高溫脅迫處理后龍牙楤木體胚SOD、POD、CAT活性的變化進行Pearson相關性分析，得出POD與CAT活性之間的相關系數(shù)r=0.983，P=0.017＜0.05，表明兩者呈顯著正相關，且龍牙楤木體胚隨著高溫脅迫處理時間的延長，POD與CAT活性都顯著低于對照組(P＜0.05)，龍牙楤木體胚的POD與CAT完全失去保護作用;而SOD與POD、CAT活性呈一定的負相關，但不顯著(P＞0.05)，龍牙楤木體胚隨著高溫脅迫處理時間的延長，SOD活性略高于對照組，差異不顯著(P＞0.05)，表明高溫脅迫處理后龍牙楤木體胚中SOD可能對其活性氧的清除起到關鍵作用;在龍牙楤木次生體胚發(fā)生過程中3種抗氧化酶活性之間相關性不顯著。

3 結論與討論

植物體在遭受高溫脅迫后，細胞內將積累大量的活性氧［13－15］，誘使細胞內合成表達抗氧化酶類以消除或緩解活性氧對細胞的毒害作用。作為內源性保護酶，SOD負責催化·轉變?yōu)镠2O2，并在過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的作用下將其分解為H2O和O2，消除高溫脅迫產生的活性氧對細胞的傷害［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫龍牙楤木體胚誘導次生體胚發(fā)生過程中，3種抗氧化酶活性均有明顯變化。高溫脅迫均使POD和CAT活性降低，而SOD活性則升高。在次生體胚發(fā)生過程中，3種過氧化物酶活性均有顯著的變化。在胚性細胞分化的早期(第10、15 d)，處理外植體的POD、SOD活性相對較高，CAT活性較低。在體胚發(fā)育過程中(第15 d以后)，SOD和POD活性都呈顯著下降趨勢(P＜0.05)，而CAT活性維持在較高的水平。由此可推測，SOD和POD對次生體胚誘導起主導作用，而CAT對體胚的發(fā)育和成熟起關鍵作用。本試驗結果同時也表明，在次生體胚發(fā)生過程中，3種抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)相互配合來調節(jié)胚性細胞的發(fā)生與發(fā)育過程，與陳義挺等［17］對龍眼體胚發(fā)生早期POD活性研究結果一致。處理1d外植體為合適的處理，其活性均高于其他處理，而其次生體胚誘導率相對較高。3種過氧化物酶活性的規(guī)律性變化，可能是在不同的細胞器中進行，從而使體胚發(fā)生過程氧化系統(tǒng)維持在一個適宜的水平，以消除高溫對體胚發(fā)生的影響。在花楸體胚發(fā)生過程中，研究者發(fā)現(xiàn)，SOD、POD活性均在胚性細胞向球形胚轉化時下降，球形胚向心形胚發(fā)育時下降，心形胚向魚雷形胚和魚雷形胚向子葉形胚發(fā)育時再升高;CAT活性變化規(guī)律與SOD、POD活性變化不同［18］，這可能是不同材料的體胚發(fā)生過程中抗氧化系統(tǒng)的協(xié)調方式不同所致。

許多資料顯示，一定濃度的H2O2對體胚產生有促進作用。枸杞體胚發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，適量濃度的H2O2對枸杞胚性細胞的形成和體細胞胚的發(fā)育有促進作用;過高的H2O2則有抑制作用［19］。本研究的高溫脅迫，同樣也產生了大量活性氧。H2O2作為一種細胞信號傳遞物質，可以通過細胞的信號傳遞系統(tǒng)影響基因的調控表達。胚性細胞的形成過程，即細胞的分化過程，其核心是基因的差異表達，H2O2可能在分子水平上誘導胚胎的發(fā)生［12］。

崔凱榮等［12］在枸杞的體胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，在胚性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基后，隨著胚性細胞的形成，SOD活性逐漸升高，當胚性細胞進一步分裂形成體細胞胚時，SOD活性達到最高峰，表明SOD活性升高對胚性細胞的分化及胚胎發(fā)育具有促進作用。原海云等［20］以連翹為試驗材料，研究高溫脅迫對連翹細胞SOD活性的影響發(fā)現(xiàn)，在12～24 h，高溫脅迫時間與連翹細胞SOD活性呈正相關，這與本試驗結果相一致。根據本試驗3種抗氧化物酶的相關分析表明，POD與CAT活性呈顯著正相關(r=0.983)，POD、CAT活性能夠準確地反映高溫脅迫龍牙楤木體胚發(fā)生隨處理時間的變化趨勢，這對研究龍牙楤木次生體胚的發(fā)生具有一定的指導意義。

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