劉建民，栗茂騰

(1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，河南 焦作 454000)

生物體內(nèi)的脂肪酸分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是對(duì)人體有重要生理活性的物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于保健品和醫(yī)藥等行業(yè)。花生四烯酸(20：4Δ5,8,11,14，arachidonic acid，AA)是研究、應(yīng)用較多的多不飽和脂肪酸之一，其廣泛分布于動(dòng)物的中性脂肪中[1]。在腦和神經(jīng)組織中，AA的含量通常占總PUFAs的40%～50%，在神經(jīng)末梢中更是高達(dá)70%，它在促進(jìn)大腦和神經(jīng)發(fā)育方面有著重要的影響[2]。前人的研究結(jié)果表明，AA在細(xì)胞內(nèi)具有第二信使的作用，參與調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)[3]；同時(shí)，在改善記憶力和視力、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中都有重要的作用[4]。

AA有重要的生理功能，但人體不能自身合成，必須從外界攝取獲得。被孢霉(Mortierella)的發(fā)酵生產(chǎn)是目前AA最主要的來源，但通過被孢霉發(fā)酵獲得的AA有較濃的產(chǎn)生菌氣味。在PUFAs的合成過程中，以雙高γ-亞麻酸(20：3Δ8,11,14，dihomo-γ-linolenic acid，DHGLA)為底物，Δ5去飽和酶催化脂肪酸鏈第5、6位碳原子間脫氫形成AA。Δ5去飽和酶是AA合成途徑中的關(guān)鍵酶，因此，克隆Δ5去飽和酶基因并對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證，可以對(duì)AA的發(fā)酵生產(chǎn)提供理論支持。

本研究以實(shí)驗(yàn)室篩選的高山被孢霉W15為材料，通過RT-PCR的方法克隆到Δ5去飽和酶基因，將該基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株后，得到了表達(dá)產(chǎn)物，這為AA新來源的拓展提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

菌株 高山被孢霉W15為實(shí)驗(yàn)室篩選和保種的菌株。

連接酶、限制性內(nèi)切酶 加拿大Fermentas公司；雙高γ-亞麻酸 美國Sigma公司；pMD18-T Simple Vector、Escherichia coli DH5α 寶生物(大連)有限公司；pPIC3.5K載體、Pichia pastoris GS115 美國Invitrogen公司；G418(遺傳霉素) Genveiw公司；A反應(yīng)液 北京天根生化科技有限公司；其他試劑為進(jìn)口試劑或國產(chǎn)分析純。

MD培養(yǎng)基：酵母氮堿基13.4g、生物素4×10-4g、葡萄糖10g，用蒸餾水定容至1L；YPD培養(yǎng)基：每升含有酵母提取物10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g；BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10g、蛋白胨20g、1mol/L磷酸鉀緩沖液100mL、酵母氮堿基13.4g、甘油10mL，定容至1L；BMMY：酵母提取物10g、蛋白胨20g、1mol/L磷酸鉀緩沖液100mL、酵母氮堿基13.4g、甲醇10mL，定容至1L。

1.2 方法

1.2.1 高山被孢霉Δ5去飽和酶基因的克隆

將高山被孢霉接種到土豆培養(yǎng)基中，25℃振蕩培養(yǎng)5d，真空抽慮收集菌體，按照Invitrogen公司的Trizol RNA提取試劑盒的說明提取高山被孢霉的總RNA，用First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)合成第一鏈cDNA。

Δ5去飽和酶基因引物參考GenBank已提交序列(AF054824)，根據(jù)Michaelson等[5]進(jìn)行設(shè)計(jì)，在上游引物引入Kozak序列[6]，引物擴(kuò)增的片段為Δ5去飽和酶基因的完整序列，引物兩端中引入EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)。Δ5L1：5’-GCGA ATTCGCCACCATGGGTACGGACCAAGGAAA-3’；Δ5R1：5’-CGGAATTCCTACTCTTCCTTGGGACGGAG-3’。

以合成的第一鏈cDNA為模板，用ToYoBo公司的KOD plus高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL。根據(jù)引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 6.0推薦的退火溫度，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性20s，57℃退火30s，68℃延伸1min 30s。

PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，回收純化PCR產(chǎn)物。由于用高保真酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平末端，因此，需對(duì)回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行加A反應(yīng)，便于與T載體的連接，取15μL回收PCR產(chǎn)物，加入4μL 5×加A反應(yīng)液和1μL 2.5U/μL Taq DNA聚合酶，混勻后，用PCR儀72℃保溫40min完成加A反應(yīng)。加A反應(yīng)的產(chǎn)物與pMD18-T Simple Vector進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用菌液PCR的方法篩選陽性克隆，送北京三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2 畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

用EcoR I酶切重組的T載體，得到Δ5去飽和酶基因片段，將該片段連接到經(jīng)EcoR I消化和CIAP去磷酸化的pPIC3.5K載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α并用50mg/mL的卡那霉素進(jìn)行篩選。為了鑒定基因在酵母表達(dá)載體上的插入方向，合成一條酵母表達(dá)載體通用引物，該引物序列位于pPIC3.5K的5’AOX1啟動(dòng)子的下游，序列如下：

5’AOX1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’。

PCR擴(kuò)增時(shí)，用5’AOX1引物和擴(kuò)增基因時(shí)使用的下游引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；取1μL菌液做模板，預(yù)變性時(shí)間為6min，其他按照擴(kuò)增基因的條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。如擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的片段相同，則可初步確定該克隆為陽性克隆且基因?yàn)檎蜻B接，該重組質(zhì)粒命名為pPIC3.5K-D5；否則是假的陽性克隆或者基因在載體中插入的方向相反。

1.2.3 重組酵母載體對(duì)畢赤酵母GS115的轉(zhuǎn)化

StuⅠ線性化重組質(zhì)粒pPIC3.5K-D5，回收后采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115，MD選擇性培養(yǎng)基平板進(jìn)行初篩。對(duì)平板上長出的菌落分別涂布在G418質(zhì)量濃度為0.5、0.75、1、2、3、4mg/mL的YPD平板進(jìn)行復(fù)篩，選擇耐受高質(zhì)量濃度G418的轉(zhuǎn)化菌株用于表達(dá)研究，同時(shí)，以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pPIC3.5K的酵母作為空白對(duì)照。

1.2.4 酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定

取200μL轉(zhuǎn)化酵母菌液，25℃、3000r/min離心2min。倒去上清，加入100μL 0.2% SDS，重新懸浮酵母菌體，把懸浮的菌液煮沸5min后，用離心機(jī)短暫離心10s。取處理后的上清1μL做模板，以Δ5L1/Δ5R1為引物，PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化酵母。

1.2.5 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

重組酵母接種到裝有10mL BMGY培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)16～18h。以1%接種量轉(zhuǎn)接到裝有50mL BMMY培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)。每24h向培養(yǎng)基中添加甲醇，使其終濃度為0.6%。持續(xù)培養(yǎng)5d，離心收集菌體，用去離子水洗滌3～4次。

1.2.6 酵母油脂的提取及脂肪酸成分分析

收獲菌體于50℃烘干后，研碎，用3mL石油醚(30～60℃沸程)抽提2次，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上快速蒸干溶劑；加入0.4mol/L KOH甲醇溶液1mL，80℃水浴中皂化3～5min，冷卻后加入14%三氟化硼乙醚甲醇溶液2mL，于80℃水浴中振蕩處理1min，待冷卻至室溫，加入正己烷1mL，加入飽和氯化鈉溶液1mL，反復(fù)顛倒幾次，靜置3～5min，上清即為甲酯化的脂肪酸正己烷溶液。

甲酯化樣品的分析在華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心完成，使用Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，儀器設(shè)置參數(shù)和分析條件如下：進(jìn)樣口溫度為250℃，50：1分流比，1μL進(jìn)樣；色譜柱用強(qiáng)極性柱HP-INNOWax(30m×0.25mm，0.25μm)；載氣為He，流速為1mL/min；升溫程序?yàn)椋?0～200℃，25℃/min；200～230℃，3℃/min；230℃保留10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 Δ5去飽和酶基因的克隆與序列分析

圖 1 高山被孢霉Δ5去飽和酶基因RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the RT-PCR product of Mortierella alpina Δ5 desaturase gene

圖 2 高山被孢霉Δ5去飽和酶基因推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of a deduced amino acid sequence of the Δ5 desaturase gene from Mortierella alpina

提取高山被孢霉W15的總RNA，以合成的cDNA為模板，擴(kuò)增得到約1400bp的片段(圖1)，與T載體連接后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，所克隆的Δ5去飽和酶基因全長1341bp(GenBank登錄號(hào)：FJ625826)，與參考Δ5去飽和酶基因核苷酸序列同源性為90%，但其推導(dǎo)氨基酸序列與參考基因編碼氨基酸序列的同源性達(dá)到了95%，這說明Δ5去飽和酶基因在不同高山被孢霉菌株中的核苷酸序列變化較大，但它們編碼的氨基酸序列相對(duì)較為保守。對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析顯示，其N末端存在去飽和酶家族廣泛存在的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域及保守的HPGG氨基酸序列，同時(shí)還存在3個(gè)保守的組氨酸富集區(qū)HDASH、HMLGHH和QAVHH(圖2中虛線表示)，這與前人的研究結(jié)果一致[5,7]。

2.2 pPIC3.5K-D5酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)畢赤酵母的轉(zhuǎn)化

圖 3 重組質(zhì)粒pPIC3.5K-D5酶切鑒定Fig.3 Identification of pPIC3.5K-D5 with EcoR Ⅰ digestion

圖 4 轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌液擴(kuò)增Δ5去飽和酶基因Fig.4 Δ5 desaturase gene amplification of recombinant P. pastoris GS115

為了驗(yàn)證Δ5去飽和酶基因的功能，將連接在T載體上的Δ5去飽和酶基因用EcoR I切下，亞克隆到經(jīng)EcoR I消化和CIAP處理的pPIC3.5K表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α后，用AOX1引物和Δ5R1引物驗(yàn)證基因插入方向。提取基因正向插入的重組質(zhì)粒，用EcoR I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。酶切后，在1400bp和9000bp處有預(yù)期條帶出現(xiàn)，證明該基因已成功亞克隆到pPIC3.5K表達(dá)載體中。

用Stu I線性化重組質(zhì)粒pPIC3.5K-D5，以電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。通過MD平板和含不同質(zhì)量濃度G418的YPD平板篩選，在4mg/mL G418的平板上得到較多的高抗性重組子。隨機(jī)挑取9個(gè)單菌落，用Δ5L1和Δ5R1引物進(jìn)行PCR鑒定，見圖4，所挑取的菌落均能擴(kuò)增出與目標(biāo)條帶大小一致的片段，這個(gè)結(jié)果表明Δ5去飽和酶基因已整合到酵母基因組中。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的GC-MS分析

圖 5 轉(zhuǎn)化Δ5去飽和酶基因酵母重組子脂肪酸GC-MS分析Fig.5 GC-MS analysis of fatty acid composition in total lipids from P. pastoris GS115 transformants

用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，以驗(yàn)證Δ5去飽和酶基因是否具有功能。在培養(yǎng)基中添加Δ5去飽和酶的作用底物雙高γ-亞麻酸，培養(yǎng)結(jié)束后分離酵母細(xì)胞并提取細(xì)胞內(nèi)中總脂肪酸，甲酯化后進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果如圖5B，添加外源雙高γ-亞麻酸作為Δ5去飽和酶底物時(shí)，重組畢赤酵母能利用該底物產(chǎn)生AA。對(duì)重組畢赤酵母的脂肪酸進(jìn)行分析表明，雙高γ-亞麻酸占總脂肪酸的0.45%，AA占酵母總脂肪酸的2.85%，說明被酵母利用的雙高γ-亞麻酸在Δ5去飽和酶的催化下，大部分轉(zhuǎn)化為AA。朱敏等[7]把高山被孢霉M6的Δ5去飽和酶基因構(gòu)建在畢赤酵母pPIC9K載體上，并在畢赤酵母中做了功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該酶能催化合成占總脂肪酸5.8%的AA生成，AA的產(chǎn)量是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的2倍。出現(xiàn)這一結(jié)果可能存在如下兩個(gè)原因：1)不同的表達(dá)載體對(duì)基因的表達(dá)量和酶活性有一定的影響，不同菌株來源的相同基因在同樣的表達(dá)載體中表達(dá)具有更好的對(duì)比性；2)這兩個(gè)基因均編碼446個(gè)氨基酸，其比對(duì)結(jié)果中僅有11個(gè)氨基酸存在差異，這揭示了不同種屬來源的相同基因，在進(jìn)化過程中，基因序列的變化導(dǎo)致氨基酸序列的改變，最終使這些基因在外源宿主中的表達(dá)水平可能會(huì)有較大的差別。因此，比較不同來源的相同基因的DNA序列和編碼的氨基酸序列，分析發(fā)生突變的氨基酸位點(diǎn)和影響酶活的關(guān)鍵位點(diǎn)，可為進(jìn)一步定向改造基因的結(jié)構(gòu)提供有力的幫助。由表1可知，重組畢赤酵母中的亞油酸(linoleic acid，LA)與含空載體酵母中LA相比，含量從9.61%提高到23.58%，說明在畢赤酵母培養(yǎng)過程中，添加一定量的外源雙高γ-亞麻酸，可能會(huì)提高LA的產(chǎn)量。

表 1 轉(zhuǎn)化Δ5去飽和酶基因的酵母的脂肪酸成分分析(n=3)Table 1 Fatty acid composition of recombinant P. pastoris GS115 (n=3)

3 討 論

花生四烯酸(AA)是一種人體必需的多不飽和脂肪酸，對(duì)嬰兒的大腦發(fā)育尤其重要[8]。微生物發(fā)酵是生產(chǎn)AA最重要的方式，高產(chǎn)菌株的篩選和發(fā)酵工藝的改進(jìn)可以提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)AA的產(chǎn)量[9-10]，利用構(gòu)建工程菌株可以增加AA生產(chǎn)菌株的來源。本研究以實(shí)驗(yàn)室篩選的高山被孢霉W15菌株為出發(fā)材料，通過RT-PCR的方法克隆了與AA合成相關(guān)的Δ5去飽和酶基因，BLAST結(jié)果表明，該基因與參考序列的同源性為90%，與GenBank所有提交序列(AF067654)的同源性最高為91%，推導(dǎo)的氨基酸序列與報(bào)道的氨基酸序列的同源性達(dá)到了95%，說明同一物種在進(jìn)化過程中，Δ5去飽和酶基因的核苷酸序列變化較大，但它們編碼的氨基酸序列相對(duì)較為保守，這在一定程度上體現(xiàn)了物種的變異是一個(gè)長期的、緩慢的過程。對(duì)Δ5去飽和酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析顯示，其N末端存在去飽和酶家族廣泛存在的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域及保守的HPGG氨基酸序列，同時(shí)還存在3個(gè)保守的組氨酸富集區(qū)，這一結(jié)果在其他的去飽和酶中也有發(fā)現(xiàn)[11-12]。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用較多的一種有效的外源基因表達(dá)系統(tǒng)。根據(jù)載體的不同，可進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)或胞外分泌表達(dá)，其生長過程中合成多種飽和和不飽和的脂肪酸，因此，是進(jìn)行研究多不飽和脂肪酸表達(dá)的系統(tǒng)之一[13-15]。本研究將克隆的Δ5去飽和酶基因連接到載體上后轉(zhuǎn)入畢赤酵母，在添加特異性底物雙高γ-亞麻酸的前提下，生成了占總脂肪酸2.85%的AA，證明該基因具有催化的活性。但AA的產(chǎn)量很低，根據(jù)對(duì)基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的分析，通過改變基因中部分堿基，從而改變其氨基酸組成及酶分子的結(jié)構(gòu)，可能會(huì)達(dá)到提高AA產(chǎn)量的目的。另外，構(gòu)建產(chǎn)AA的基因工程菌，必須要考慮基因表達(dá)載體及工程菌產(chǎn)物對(duì)人、動(dòng)物和環(huán)境的安全。一般認(rèn)為，安全的微生物基因作為載體，修飾后不留下任何抗生素基因才是安全的[16]。本實(shí)驗(yàn)中所用到的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5K具有氨芐青霉素和卡那霉素兩個(gè)抗性基因，在進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)還需要添加甲醇做誘導(dǎo)，因此，使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)供人類利用的產(chǎn)物時(shí)，需要對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行改造，消除抗生素基因，改變與甲醇誘導(dǎo)相關(guān)的基因序列和選擇其他安全的誘導(dǎo)物，保證產(chǎn)物對(duì)人類的安全。

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