王文婷，鄔應(yīng)龍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)是一種優(yōu)良的天然高分子化合物，屬于理想的膳食纖維。已有研究表明KGM對(duì)人體能起到一定的保健作用[1]，它具有減肥、降低餐后血糖水平、降低血膽固醇含量及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等生理功能[2-5]。但對(duì)氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM)的研究大量集中于其加工方法及相關(guān)理化性質(zhì)如流變性、膠凝性等[6-7]，最近有報(bào)道表明其具有一定的免疫功能[8]，而OKGM對(duì)機(jī)體腸道微環(huán)境影響的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。十二指腸為小腸第一段，消化吸收能力較強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)以此為代表，通過(guò)檢測(cè)飼喂添加不同劑量OKGM的高脂飼料的C57BL/6J小鼠的十二指腸形態(tài)考察OKGM對(duì)高脂飲食小鼠的小腸功能的影響，并通過(guò)16S rDNA的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)研究OKGM對(duì)高脂飲食小鼠腸道菌群的影響，從而為探索OKGM的生理功能并將其應(yīng)用于功能性食品的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.Z.N.A?Stool DNA Kit 美國(guó)Omega公司；Tris美國(guó)Sigma公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素(分析純) 美國(guó)Amresco公司；OKGM 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院功能性食品實(shí)驗(yàn)室自制，將KGM經(jīng)H2O2氧化降解而得到[9]。

1.2 儀器與設(shè)備

WH-866渦旋混合器 江蘇太倉(cāng)華美生化儀器廠；5415D高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Bio-Rad PCR儀、Bio-Rad DGGE系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與管理

表 1 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Diet composition and nutrition levels

健康雄性C57BL/6J小鼠，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼喂基礎(chǔ)飼料1周后，選擇60只體質(zhì)量為(21±2)g的小鼠隨機(jī)分成5組：高脂對(duì)照組(HF組)、基礎(chǔ)對(duì)照組(CL組)、添加低劑量(12.5g/kg)OKGM高脂飼料組(HF-LOKGM組)、添加中劑量(25.0g/kg)OKGM高脂飼料組(HF-MOKGM組)及添加高劑量(50.0g/kg)OKGM高脂飼料組(HF-HOKGM組)，每組12只，每籠2只。小鼠自由采食、飲水，10h:14h晝暗交替，飼養(yǎng)12周。各組小鼠飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1[10-12]。

1.3.2 糞樣及十二指腸的采集

第12周末，取小鼠新鮮糞便，迅速裝入滅菌1.5mL離心管中，于－20℃保存，備用。小鼠只供給飲水，禁食12h后處死，然后迅速取出小鼠腸組織，于各組小鼠十二指腸部位取長(zhǎng)約1～2cm腸段，用甲醛緩沖液固定。

1.3.3 腸絨毛的檢測(cè)

將固定的小鼠十二指腸進(jìn)行HE染色，采集圖像并測(cè)量腸絨毛高度與隱窩深度。

1.3.4 腸道微生物DNA的提取

采用美國(guó)Omega公司的E.Z.N.A?Stool DNA Kit試劑盒提取，提取的DNA于－20℃保存，備用。

1.3.5 腸道微生物16S rDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增

選取16S rDNA通用引物[13]：上游引物為5’-CGC C C G G G G C G C G C C C C G G G C G G G G C G G G G G C A CG G G G G G A C T C C T A C G G G A G G C A G C A G T-3’，攜帶GC夾板；下游引物為5’-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’。采用25μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 10.5μL、2×mix 12.5μL、上游引物和下游引物各0.5μL、DNA模板1μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.6 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

采用Bio-Rad Dcode系統(tǒng)進(jìn)行DGGE。DGGE條件參考文獻(xiàn)[14]稍作改動(dòng)：凝膠梯度為35%～65%，使用1×TAE緩沖液，60℃、200V預(yù)電泳10min，100V固定電壓電泳16h。采用硝酸銀染色[15]并拍照。

1.3.7 數(shù)據(jù)及圖像處理

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。DGGE指紋圖譜通過(guò)Quantity One 4.6.2軟件，采用UPGMA進(jìn)行相似性聚類(lèi)分析，多樣性指數(shù)用Shannon-Weiner指數(shù)(H’)表示，按照如下公式計(jì)算[16]：

H’=－∑PilnPi

式中：Pi=ni/H，ni為某一條帶的峰高，H為泳道密度曲線所有的峰高的總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 OKGM對(duì)高脂飲食C57BL/6J小鼠腸絨毛形態(tài)的影響

圖 1 C57BL/6J小鼠十二指腸形態(tài)觀察(HE染色，×100)Fig.1 Duodenal morphology of C57BL/6J mice (HE staining, × 100)

由圖1可知，CL組小鼠十二指腸絨毛較長(zhǎng)且完整，HF組小鼠腸絨毛脫落嚴(yán)重，而HF-HOKGM組腸絨毛較CL組短，但比HF組長(zhǎng)且相對(duì)完整。

表 2 C57BL/6J小鼠十二指腸黏膜結(jié)構(gòu)的變化(±s，n =12)Table 2 Structure changes of the duodenum mucosa of C57BL/6J mice(±s，n =12)

表 2 C57BL/6J小鼠十二指腸黏膜結(jié)構(gòu)的變化(±s，n =12)Table 2 Structure changes of the duodenum mucosa of C57BL/6J mice(±s，n =12)

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示有顯著差異(P ＜0.05)。

組別 十二指腸絨毛高度DV/μm 十二指腸隱窩深度DC/μm 十二指腸絨腺比(DV/DC)HF組 299.88±12.21d 108.71±3.60a 2.76±0.16e CL組 583.69±14.90a 74.68±1.48c 7.82±0.05a HF-HOKGM組 558.57±9.45b 78.60±3.09bc 7.11±0.16b HF-MOKGM組 424.49±16.11c 81.23±4.64bc 5.23±0.14c HF-LOKGM組 322.02±11.75 d 82.21±4.83b 3.92±0.15d

由表2可見(jiàn)，CL組十二指腸絨毛高度顯著大于其他組(P＜0.05)，HF組與HF-LOKGM組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而HF-LOKGM組、HF-MOKGM組和HF-HOKGM組3組間均差異顯著(P＜0.05)；HF組十二指腸隱窩深度顯著大于其他組(P＜0.05)，CL組、HF-HOKGM組和HF-MOKGM組3組間不存在顯著差異(P＞0.05)；CL組絨腺比顯著大于其他組(P＜0.05)，HF組顯著小于其他組(P＜0.05)，而H F-H O K G M 組、H F-M O K G M 組 與H F-L O K G M 組 間 均 存在顯著差異(P＜0.05)，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

2.2 OKGM對(duì)高脂飲食C57BL/6J小鼠腸道菌群的影響

2.2.1 C57BL/6J小鼠腸道菌群16S rDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的微生物DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，均能得到約200bp的目的產(chǎn)物，且條帶清晰明亮，滿足DGGE分析的要求，如圖2所示。

圖 2 C57BL/6J小鼠腸道菌群16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of 16S rDNA V3 region from intestinal flora of C57BL/6J mice

2.2.2 C57BL/6J小鼠腸道菌群PCR-DGGE指紋圖譜的建立與分析

C57BL/6J小鼠腸道菌群16S rDNA V3區(qū)片段的DGGE圖譜的建立及其聚類(lèi)分析和相似系數(shù)見(jiàn)圖3、4和表3。

圖 3 C57BL/6J小鼠腸道菌群16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE圖譜Fig.3 DGGE profile of 16S rDNA amplification products from intestinal flora of C57BL/6J mice

圖 4 C57BL/6J小鼠腸道菌群的PCR-DGGE圖譜的聚類(lèi)分析Fig.4 Cluster analysis of the PCR-DGGE profile of intestinal flora in C57BL/6J mice

由圖4可知，HF-HOKGM組與HF-MOKGM組相似度最高，被聚為一類(lèi)，HF組與其他組相似度最低，不與其他組聚為一類(lèi)。

表 3 C57BL/6J小鼠腸道菌群的PCR-DGGE圖譜的相似系數(shù)(q)Table 3 Similarity coefficients of the PCR-DGGE profile of intestinal flora in C57BL/6J mice

[17]知當(dāng)0＜q＜25.0時(shí)，極不相似；當(dāng)25.0≤q＜50.0時(shí)，中等不相似；當(dāng)50.0≤q＜75.0時(shí)，中等相似；當(dāng)75.0≤q＜100.0時(shí)，極相似。由表3可知，CL組與HF-HOKGM組相似系數(shù)為53.9，屬于中等相似，與HF組相似系數(shù)最小，為43.6，屬于中等不相似，但與HFMOKGM組、HF-LOKGM組也屬于中等不相似。這說(shuō)明OKGM能改善高脂飲食C57BL/6J小鼠的腸道菌群構(gòu)成，使其更相似于攝入基礎(chǔ)飼料的對(duì)照組，而改善程度與OKGM添加量相關(guān)。

圖 5 C57BL/6J小鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)Fig.5 Shannon diversity index of the PCR-DGGE profile of intestinal flora in C57BL/6J mice

由圖5可見(jiàn)，CL組小鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)顯著大于其他組，HF-LOKGM組、HF-MOKGM組與HF組的多樣性指數(shù)無(wú)顯著差異，但HF-HOKGM組的多樣新指數(shù)顯著大于HF組，說(shuō)明適量OKGM能改善高脂飲食小鼠腸道菌群的多樣性，維持菌群平衡。

3 討 論

小腸的絨毛高度、隱窩深度等都是反應(yīng)小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)，能夠反映腸道的健康水平。絨毛高度增加可以使小腸吸收面積增大，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隱窩深度的減小說(shuō)明絨毛上皮成熟細(xì)胞率上升，分泌功能增強(qiáng)。營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)的研究指出絨毛高度與隱窩深度的比值(絨腺比)表明小腸上皮細(xì)胞更新代謝程度，能夠綜合反映小腸的功能狀況，有相關(guān)報(bào)道[18]也得到同樣結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與基礎(chǔ)飼料對(duì)照組相比，高脂飲食C57BL/6J小鼠十二指腸絨毛高度、隱窩深度、絨腺比變化顯著，損傷明顯。而適量的OKGM能夠使高脂飲食小鼠的腸絨毛高度增大，隱窩深度減小，絨腺比增大，減弱了腸黏膜的損傷。這可能由于高脂攝入引起小鼠小腸細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致了腸黏膜上皮細(xì)胞數(shù)量減少、絨毛變短脫落，而OKGM有較大的黏度，能覆蓋在腸黏膜表面形成保護(hù)屏障[19]。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法僅能培養(yǎng)出少量腸道微生物，不能準(zhǔn)確反映菌群的多樣性。而變性梯度凝膠電泳(DGGE) 技術(shù)具有快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)，采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增菌群總DNA的16S rDNA V3高變區(qū)，通過(guò)分析其核酸序列多樣性而獲知菌群多樣性情況，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比能獲得更豐富的菌群信息。近些年，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變形梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)也逐漸應(yīng)用于食品中微生物的檢測(cè)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)研究OKGM對(duì)高脂飲食C57BL/6J小鼠腸道菌群的影響，結(jié)果表明高脂飲食會(huì)改變小鼠的腸道菌群，高脂對(duì)照組與基礎(chǔ)對(duì)照組小鼠的腸道菌群為中等不相似，但飼喂了添加適量OKGM高脂飼料的小鼠的腸道菌群更相似于基礎(chǔ)對(duì)照組；此外，高脂對(duì)照組小鼠的腸道菌群多樣性指數(shù)顯著小于基礎(chǔ)對(duì)照組，而菌群多樣性指數(shù)是反映菌群平衡的重要指標(biāo)，通常該數(shù)值越大，菌群平衡就越難被破壞[22]，這說(shuō)明高脂飲食小鼠的菌群平衡可能更易被破壞，而與高脂對(duì)照組相比，OKGM高脂飼料組小鼠的腸道菌群多樣性指數(shù)有所增大，尤其高劑量OKGM高脂飼料組與高脂對(duì)照組相比，差異顯著。這可能是因?yàn)橹?lèi)代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物如硫化氫等破壞菌群賴以生存的微環(huán)境，使對(duì)機(jī)體有益的菌群的整體種類(lèi)或個(gè)體數(shù)量減少而有害的菌群則相應(yīng)增加[23-24]，而OKGM可以作為一種外源性益生元增加有益菌的數(shù)量，同時(shí)它在降解成寡糖后又在不提供有害菌生長(zhǎng)必需營(yíng)養(yǎng)素的前提下與有害菌競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合使得有害菌死亡[25]。

綜上可見(jiàn)，OKGM能夠減弱高脂飲食引起的小鼠腸黏膜損傷，起到保護(hù)小腸絨毛形態(tài)的作用，同時(shí)它還能夠改善高脂飲食小鼠的腸道菌群，維持腸道菌群的多樣性。OKGM在功能性食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中值得進(jìn)一步研究。

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