欒同青，李志軍，鐘其頂，孟 鎮(zhèn)，熊正河，*，李 藝，李敬龍

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；3.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京100027；4.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

黃酒是中國的傳統(tǒng)酒種，其風(fēng)味物質(zhì)及有害物質(zhì)的生成與發(fā)酵過程微生物菌群結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[1]。黃酒釀造過程微生物種類和數(shù)量繁多，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和相互作用機(jī)理復(fù)雜，以往的研究多是采用傳統(tǒng)平板對(duì)黃酒麥曲中的細(xì)菌進(jìn)行分離并鑒定，不能快速、全面分析出細(xì)菌群落的整體結(jié)構(gòu)，而與傳統(tǒng)方法相比，分子生物學(xué)技術(shù)在研究微生物多樣性方面具有明顯的優(yōu)勢。近年來，很多學(xué)者利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)不同樣品進(jìn)行了微生物多樣性分析，包括對(duì)土壤[2]、活性污泥[3-4]、大醬[5]、飲用水[6]、白酒大曲[7]、糟醅[8]、酒醅[9]和腸道菌群[10]等樣品的研究，結(jié)果表明，該技術(shù)在揭示環(huán)境微生物多樣性、種群差異等方面具有一定優(yōu)越性。截至目前，尚未見采用PCR-DGGE技術(shù)研究黃酒釀造過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的報(bào)道，本文采用該技術(shù)初步研究了黃酒工業(yè)化生產(chǎn)條件下浸米水、麥曲和酒母及發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及變化情況，為進(jìn)一步研究細(xì)菌對(duì)黃酒風(fēng)味物質(zhì)的影響和黃酒質(zhì)量安全問題奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一個(gè)完整釀造流程中的浸米水、麥曲、酒母、前酵液（前酵第1、2、3、4d樣品）、后酵液（后酵第3、6、9、13、16d樣品） 浙江某黃酒廠；引物：F338GC/R518（F338GC：5’-CGCCCGGCCGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGAGGCAGCAG-3’、下劃線部分為GC夾、518R：5’-ATTACCGCGGCT GCTGG-3’）、F338/R518、M13F/M13R（M13F：5’-TG TAAAACGACGGCCAGT-3’、M13R：5’-CAGGAAACA GCTATGACC-3’、dNTPs、X-gal、IPTG 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TransTaqTM HiFi DNA Polymerase、DNA純化試劑盒、pEASY-T3 Cloning Kit、Trans1-T1 北京全式金生物科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、SDS 北京全新拓達(dá)科技有限公司；去離子甲酰胺、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N，N，N’，N’-四甲基二乙胺 Sigma公司。

恒溫生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；高速冷凍離心機(jī) Sigma公司；梯度PCR儀 Biometra公司；水平電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像儀 Vilber lourmat公司；變性梯度凝膠電泳儀 Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別稱取3g浸米水、麥曲、酒母、前酵液（1、2、3、4d）和后酵液（3、6、9、13、16d）樣品，采取文獻(xiàn)[11]方法提取本實(shí)驗(yàn)樣品基因組DNA。采用降落PCR法對(duì)提取DNA的16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE實(shí)驗(yàn)，最后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，送交測序公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGGE圖譜分析

圖1為黃酒釀造過程不同樣品的細(xì)菌DGGE圖譜。DGGE電泳圖譜中不同位置的條帶代表了不同種屬的細(xì)菌；條帶的亮度反映了該細(xì)菌的豐度，條帶越亮，表明該細(xì)菌的相對(duì)含量可能越大。由圖1可以看出，各樣品的電泳條帶分離效果較好，條帶亮度各有不同，A、C、D、G為所有樣品共有條帶；浸米水樣品D條帶代表的細(xì)菌含量相對(duì)最豐富，并含有其他樣品不存在的細(xì)菌I和細(xì)菌J；麥曲樣品條帶較為繁雜，條帶G和K代表的細(xì)菌含量相對(duì)豐富；酒母與前酵液樣品條帶較相似；后酵液各階段樣品條帶較相似，且D、E、F條帶代表的細(xì)菌含量隨發(fā)酵時(shí)間呈逐漸升高趨勢。細(xì)菌G存在于黃酒釀造全過程，是發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌。圖1顯示，發(fā)酵液樣品中至少含有14個(gè)清晰條帶，這表明在發(fā)酵過程中存在較高的細(xì)菌多樣性。圖2為黃酒釀造過程不同樣品之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的相似度。由圖2可以看出，前酵樣品之間較為相似，后酵樣品之間較為相似，前酵樣品與后酵樣品之間存在較大差異，相似度僅為58%。

圖1 黃酒釀造過程細(xì)菌DGGE圖譜Fig.1 The DGGE profile of the bacteria during the rice wine fermentation process

圖2 黃酒釀造過程不同樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的相似度Fig.2 The similarity of bacterial community structure between different samples during the rice wine fermentation process

為進(jìn)一步分析黃酒釀造過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，利用Quantity one等軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行Shannon指數(shù)（H’）分析，評(píng)估樣品中細(xì)菌的多樣性；微生物區(qū)系菌群均勻度（E）分析，評(píng)估某一樣品中各細(xì)菌分布的均勻情況，結(jié)果見表1。

由圖1和表1可以看出，黃酒釀造過程細(xì)菌的多樣性隨著釀造時(shí)間的延續(xù)呈現(xiàn)先升高，而后逐漸穩(wěn)定的趨勢，細(xì)菌種類增加，細(xì)菌總量分布趨于均勻。浸米水中細(xì)菌多樣性相對(duì)較低，細(xì)菌總量分布不均，D條帶代表的細(xì)菌總量較為豐富；麥曲和酒母的細(xì)菌多樣性較為復(fù)雜；前酵過程細(xì)菌多樣性基本呈現(xiàn)上升趨勢，細(xì)菌種類在逐漸增加，但均勻度變化不大；后酵開始階段細(xì)菌種類較多，而后呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢。

表1 黃酒釀造過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Table 1 Analysis of the changes of bacterial community structure during the rice wine fermentation process

2.2 釀造過程細(xì)菌群落多樣性分析

為進(jìn)一步探明黃酒釀造過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，對(duì)DGGE圖譜中的條帶進(jìn)行切膠回收、克隆轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選和陽性克隆驗(yàn)證等一系列操作后進(jìn)行測序，將測序得到的目的序列，通過NCBI進(jìn)行同源性搜索以及相關(guān)信息檢索，與數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，黃酒釀造過程中存在乳桿菌（Lactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）、布丘氏菌（Buttiauxella）和不可培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium）等種類，見表2。此結(jié)果與張中華等[12]檢測的黃酒麥曲中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，都檢測到含有Saccharopolyspora和Enterobacteriaceae，此外還檢測到了Lactobacillus和Staphylococcus，但未檢測出致病菌Clavibacter michiganensis；本實(shí)驗(yàn)檢測出三株乳桿菌，與章銀珠等[13]運(yùn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)基法在黃酒中檢測出較多的乳酸桿菌結(jié)果相似。由圖1可見，Lactobacillus pentosus strain和Saccharopolyspora sp.由麥曲帶入發(fā)酵液，且在后酵階段含量較為豐富，Lactobacillus coryniformis strain由酒母帶入發(fā)酵液，且在前酵階段含量相對(duì)豐富。在黃酒發(fā)酵過程中含有較多的乳酸菌A、B、E，并檢測到了不可培養(yǎng)細(xì)菌F、G、J，其中，不可培養(yǎng)菌G還是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群。

黃酒的釀造流程分為浸米、蒸米、攤涼、前酵、后酵和過濾煎酒等過程，麥曲和酒母在大米攤涼后與原料一起進(jìn)入發(fā)酵過程。黃酒釀造過程細(xì)菌的多樣性呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢，原因可能是前酵過程發(fā)酵溫度高（26～34℃）、營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣充足、酒精度相對(duì)較低（由0°增長至14°左右），適宜微生物的大量繁殖；后酵過程實(shí)行控溫發(fā)酵，發(fā)酵溫度低（15℃左右）、酒精度較高（后酵結(jié)束增長至17°左右）、pH偏低（3.0～4.0），大部分微生物的繁殖受到抑制[14-16]。Lactobacillus plantarum strain（A）、Staphylococcus sp.（C）和Enterobacteriaceae bacterium（D）等屬于需氧或兼性厭氧菌，前酵過程的發(fā)酵條件適宜它們的生長，在大量繁殖后進(jìn)入后酵過程而趨于平穩(wěn)。Lactobacillus pentosus strain（B）等屬于厭氧型細(xì)菌，且具有較強(qiáng)的耐酸能力，其在后酵過程含量較為豐富。Saccharopolyspora sp.（K）等菌在前酵過程含量較為平穩(wěn)，進(jìn)入后酵過程后，其含量逐漸降低，可能是后酵過程的低溫、高酒精度和低pH導(dǎo)致了它們的衰退。

研究表明，在黃酒釀造過程中乳桿菌（Lactobacillus）可以產(chǎn)生乳桿菌素，對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、假單胞菌和黃曲霉具有一定的抑制作用[17-18]，何煜波等[19]對(duì)Lactobacillus plantarum的基本性狀進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該菌對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有一定的抑制作用；祝嫦巍等[20]對(duì)Lactobacillus pentosus研究發(fā)現(xiàn)，其不僅對(duì)革蘭氏陽性菌有抑制作用，而且對(duì)沙門氏菌等革蘭氏陰性菌也有一定的抑制作用；陳堅(jiān)等[21]篩選出一株抑制生物胺產(chǎn)生的Lactobacillus coryniformis，該菌產(chǎn)生的細(xì)菌素具有較廣的抑菌譜。糖多孢菌（Saccharopolyspora）是尋找新的生物活性物質(zhì)的重要菌源，某些種能產(chǎn)生重要的生物活性物質(zhì)，如抗生素、酶類、維生素等，紅色糖多孢菌具有產(chǎn)紅霉素的能力[22]。布丘氏菌（Buttiauxella izardii）具有產(chǎn)植酸酶的能力，2009年丹尼斯科美國公司公布了一種可以應(yīng)用于植酸酶工業(yè)生產(chǎn)的布丘氏菌[23]。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree

表2 DGGE條帶序列分析Table 2 Sequence analysis of DGGE bands

用軟件MEGA5對(duì)測序結(jié)果和GenBank中相關(guān)種屬代表菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出A、B、C三種菌的親緣關(guān)系較近，D、E、I、J四種菌的親緣關(guān)系較近，H、K兩種菌的親緣關(guān)系較近，不可培養(yǎng)菌F、G與其他菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論

本文采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)黃酒釀造過程的浸米水、麥曲、酒母、前酵液和后酵液進(jìn)行分析，以研究黃酒釀造過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。研究結(jié)果顯示，黃酒釀造過程細(xì)菌的多樣性呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢，原因可能與黃酒釀造過程不同階段的環(huán)境條件有關(guān)。浸米水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單，麥曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，前酵樣品與后酵樣品之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，相似度僅為58%。

黃酒釀造過程中存在乳桿菌（Lactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）、布丘氏菌（Buttiauxella）和不可培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium）等種類。浸米水中存在獨(dú)有的Buttiauxella和Uncultured bacterium；麥曲中Saccharopolyspora含量豐富；前酵和后酵樣品中Enterobacteriaceae和Uncultured bacterium含量相對(duì)豐富。

本研究從黃酒釀造過程中檢出多株乳桿菌，說明乳桿菌對(duì)黃酒的發(fā)酵具有相對(duì)較大的影響，此外還檢出了不可培養(yǎng)的優(yōu)勢菌，其在黃酒釀造過程中的作用有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

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