王國盼，蘇宏飛，+，韋春葵，熊思馳，黃 飛，李 麗，黃時海，*

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.南寧高新區(qū)，廣西南寧530007）

維生素D3羥基化成活性形式如1α羥基維生素D3、25羥基維生素D3和1α，25位二羥基維生素D3才能發(fā)揮生理活性[1]。研究發(fā)現(xiàn)活性維生素D3可調(diào)節(jié)細(xì)胞繁殖和分化[2]?；钚跃S生素D3廣泛應(yīng)用于一些疾病的臨床治療[3]。許多絲狀真菌及放線菌具有甾醇羥基化能力，該羥基化作用主要由P450酶催化[4]。微生物的P450和電子傳遞鏈相關(guān)的蛋白大都在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)膜，屬于胞內(nèi)酶。因此發(fā)酵往往受到細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的影響。維生素D3并非P450羥化酶的天然底物[5]，因此研究作用于細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和底物的物質(zhì)對于微生物羥基化甾醇和維生素D3具有重要意義。近年來，β-環(huán)糊精與表面活性劑等在水溶液中的相互作用對于生命科學(xué)相關(guān)的囊泡形成以及蛋白質(zhì)分子折疊有重要影響[6]。水相中β-環(huán)糊精與表面活性劑的相互作用主要是前者的憎水性分子內(nèi)孔容納后者的疏水性基團形成包合物[7]。有些表面活性劑通透性，活化微生物細(xì)胞膜并促進(jìn)底物、產(chǎn)物的傳遞和運輸，從而影響物質(zhì)代謝和細(xì)胞生長。Fu jii Y等[5]研究證明，β-環(huán)糊精能提高25位羥化維生素D3產(chǎn)率。前期實驗中紫外誘變選育獲得了一株產(chǎn)維生素D羥化酶的放線菌CXX-10突變株。其所產(chǎn)羥化酶為胞內(nèi)酶，若直接用菌體轉(zhuǎn)化反應(yīng)，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜會阻礙底物及產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外的交換，羥基化產(chǎn)率較低。因此尋找一種既能使產(chǎn)羥化酶菌株細(xì)胞膜活化，又不與維生素D3競爭包容于β-環(huán)糊精的表面活性劑，對共同發(fā)揮兩者的促發(fā)酵優(yōu)勢是必要和可行的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

放線菌CXX-10突變株 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品與發(fā)酵工程研究所保藏保存；維生素D3、25羥基維生素D3、β-環(huán)化糊精 Sigma公司；表面活性劑 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑 為國產(chǎn)分析純；ISP2固體培養(yǎng)基[8]葡萄糖10g，酵母膏10g，麥芽汁10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.5；種子培養(yǎng)基 可溶性淀粉20g，K2HPO41g，KNO30.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖10g，魚粉10g，K2HPO41g，KNO30.5g，NaCl 1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水1000mL，pH6.0～8.5。

LC-10AVP型高效液相色譜儀 日本島津公司；移液槍 日本立洋公司；電子分析天平 MEITLER公司；YP1200電子天平 上海精科有限公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng) 將ISP2培養(yǎng)基斜面上的單菌落接種到裝有玻璃珠的種子培養(yǎng)基中，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)72h作為種子液。

1.2.2 25-羥基維生素D3含量的測定 按照改進(jìn)的Bligh-Dyer[9]方法制備得到粗品。粗品溶解于乙腈，HPLC檢測25-（OH）D3含量[10]。產(chǎn)率計算公式：產(chǎn)率=液相檢測濃度×濃縮液體積/樣品總體積。

1.2.3 表面活性劑和環(huán)化糊精最佳組合的選擇 以50mL/250mL的發(fā)酵液/三角瓶裝液量，將培養(yǎng)好的種子液按3%接種量接入帶有玻璃珠的發(fā)酵培養(yǎng)液中，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)72h。添加乙醇溶解的終濃度為0.1mg/mL的維生素D3，實驗組一：同時添加濃度為0.02%的各種表面活性劑或者只添加0.5% β-環(huán)化糊精，其他條件不變的情況下發(fā)酵。實驗組二：同時添加濃度為0.02%的各種表面活性劑和0.5% β-環(huán)化糊精，其他條件不變的情況下發(fā)酵?？瞻讓φ战M：不添加表面活性劑和β-環(huán)化糊精。每個因素做3個平行實驗，28℃，180r/min，發(fā)酵轉(zhuǎn)化96h。測定25-羥基維生素D3含量。

1.2.4 菌絲體干重的測定 以50mL/250mL的裝液量，接入0.25mL出發(fā)菌株的孢子懸浮液于帶有玻璃珠的濃度為0.02%不同表面活性劑的菌絲培養(yǎng)液中，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)96h。用蒸餾水將菌絲體沖洗3次后真空抽濾，將抽濾好的菌絲體置于65℃的烘箱烘干至恒重，用電子天平稱其重量。

1.2.5 表面活性劑和環(huán)化糊精較佳組合的發(fā)酵條件優(yōu)化 根據(jù)上述實驗，選取較佳的表面活性劑和環(huán)化糊精組合，優(yōu)化添加濃度、發(fā)酵溫度、pH、培養(yǎng)時間和添加時間等條件，研究其對羥基化產(chǎn)物產(chǎn)率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面活性劑和環(huán)化糊精較佳組合的選擇

由圖1可知，Tween-80和Glycein（甘油）單獨作用可提高25-羥基維生素D3的產(chǎn)率，Triton-100、SDS和CTAB可抑制25-羥基維生素D3的生成。β-環(huán)化糊精單獨作用也可提高25-羥基維生素D3的產(chǎn)率。表面活性劑Tween-80、甘油與β-環(huán)化糊精共同作用能較大程度地提高25-羥基維生素D3的產(chǎn)率。依據(jù)實驗結(jié)果，可選擇Tween-80和β-環(huán)化糊精組合做進(jìn)一步研究。

圖1 表面活性劑和β-環(huán)糊精對25-（OH）VD3產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of various surfactants and β-CD on productivity of 25-（OH）VD3

對于實驗結(jié)果，分析認(rèn)為：放線菌CXX-10細(xì)胞壁受到一些表面活性劑的影響變得松弛，如Tween-80和Glycein，從而有利于底物維生素D3到達(dá)細(xì)胞膜并通過協(xié)助擴散進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。表面活性劑一般來說具有活化細(xì)胞膜的作用，但有些表面活性劑可能也會過度損傷細(xì)胞膜，抑制菌體的生長，不利于酶的生成[11]。進(jìn)一步研究各種表面活性劑對菌體生長的影響。β-環(huán)化糊精與維生素D3形成復(fù)合物，有利于維生素D3溶于發(fā)酵液，從而增大細(xì)胞與維生素D3接觸幾率。另外β-環(huán)化糊精與維生素D3形成復(fù)合物有可能使維生素D3構(gòu)象發(fā)生變化，形成的復(fù)合物能更好地結(jié)合到羥化酶結(jié)合位點[5]。此外，其他可能的原因是β-環(huán)化糊精疏水性的內(nèi)腔可包容產(chǎn)物25-（OH）D3，從而間接降低代謝產(chǎn)物積累，減少羥基化產(chǎn)物對羥基化酶的反饋抑制作用，從而有利于產(chǎn)物的合成。而Tween-80、甘油與β-環(huán)化糊精共同作用，可能綜合提高了維生素D3溶解度、運輸和酶作用效率等，增加羥基維生素D3產(chǎn)率的效果更加明顯。依據(jù)實驗結(jié)果，可選擇Tween-80和β-環(huán)化糊精組合做進(jìn)一步研究。

2.2 表面活性劑對菌體生長的影響

有些表面活性劑通透性，活化微生物細(xì)胞膜并促進(jìn)底物、產(chǎn)物的傳遞和運輸，從而影響物質(zhì)代謝和細(xì)胞生長。各種表面活性劑對CXX-10突變菌株生長的影響表1所示。

由表1可知，Tween-80和Glycein對菌體的生長影響不大，SDS、CTAB和Triton-100對菌體的生長影響大，抑制菌體的生長。因此選擇合適的表面活性劑對羥化菌株的生產(chǎn)很重要。

表1 Tween-80和β-環(huán)化糊精濃度對菌體生長的影響Table 1 Effect of β-CD and Tween-80 on mycelia growth

2.3 添加表面活性劑Tween-80和β-環(huán)化糊精較適濃度

由表2可知，固定Tween-80的濃度不變，在0.5%～1.5%范圍內(nèi)，25-（OH）VD3產(chǎn)率隨β-CD濃度的增高而降低；固定β-CD的濃度不變，在0.02%～0.06%范圍內(nèi)，25-（OH）D3產(chǎn)率隨Tween-80濃度的變化先升高后降低；同時添加β-CD和Tween-80的較適濃度分別為0.5%和0.04%。在此條件下25-（OH）D3產(chǎn)率達(dá)14.0mg/L。

表2 Tween80和β-環(huán)化糊精濃度對25-（OH）D3產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of β-CD and Tween-80 density on productivity of 25-（OH）D3

2.4 發(fā)酵溫度對25-（OH）D3產(chǎn)率的影響

設(shè)置不同溫度的搖床，其他條件不變的情況下，添加乙醇溶解的維生素D3，同時添加0.04% Tween-80和0.5% β-環(huán)化糊精進(jìn)行實驗對照，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)96h后，提取產(chǎn)物檢測。如圖2所示，添加或者不添加表面活性劑Tween-80和β-環(huán)化糊精的較適溫度均為28℃。其可能原因是羥化酶是蛋白酶，隨著溫度升高酶活增高，達(dá)到最適溫度后，蛋白酶開始因溫度升高慢慢失活，造成酶活降低。

2.5 pH對25-（OH）D3產(chǎn)率的影響

根據(jù)上述實驗得出的較適條件，配制不同pH的發(fā)酵液，以不添加Tween-80和β-環(huán)化糊精為對照組，其他條件不變，轉(zhuǎn)化反應(yīng)完成后提取產(chǎn)物檢測。結(jié)果如圖3所示，添加、不添加表面活性劑Tween-80和β-環(huán)化糊精的較適pH都為7.0。可能的原因是羥化酶是蛋白酶，溶液的pH會影響底物的解離狀態(tài)，影響底物與酶的結(jié)合。

圖3 pH對25（OH）D3產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of pH value on productivity of 25（OH）D3

2.6 發(fā)酵轉(zhuǎn)化時間對25-（OH）D3產(chǎn)率的影響

在以上優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，以不添加Tween-80和β-環(huán)化糊精為對照組，分別在發(fā)酵3、5、7、9、11d后取樣，提取產(chǎn)物檢測。如圖4所示，添加表面活性劑Tween-80和β-環(huán)化糊精后，25-（OH）D3產(chǎn)率隨發(fā)酵時間的延長而提高，但發(fā)酵7d后產(chǎn)率不再增加。對照組在7d時產(chǎn)率最大，隨后有所回落。有可能β-環(huán)化糊精包容產(chǎn)物，使其不容易變質(zhì)，所以在產(chǎn)率最高發(fā)酵時間7d后，產(chǎn)物沒有明顯的降低。而空白對照組在產(chǎn)率最高發(fā)酵時間7d后，產(chǎn)物有明顯下降趨勢。但考慮到發(fā)酵工藝要求，較適發(fā)酵時間以7d為宜。

圖4 發(fā)酵時間對產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on productivity

2.7 表面活性劑Tween-80和β-環(huán)化糊精添加時間對產(chǎn)率的影響

圖5 Tween-80和β-CD添加時間對產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of addition time of Tween-80 and β-CD on productivity

在以上優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，保持其他條件不變，以不添加Tween-80和β-環(huán)化糊精為對照組，分別在培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7d時添加Tween-80、β-環(huán)化糊精和VD3，發(fā)酵轉(zhuǎn)化至第8d后提取產(chǎn)物檢測。如圖5可知，實驗組在培養(yǎng)3d時添加，產(chǎn)物25-（OH）D3產(chǎn)率最高，達(dá)到了14.5mg/L；對照組也是在第3d時添加VD3合適，過早或延后均不利于菌體的羥基化能力?？赡艿脑蚴?d時菌體處在對數(shù)生長期，菌體較多，酶活較高，反應(yīng)時間充足。

3 結(jié)果與討論

通過研究表面活性劑、β-環(huán)化糊精及其共同作用對放線菌CXX-10誘變菌株羥基化維生素D3的影響，選擇了促進(jìn)作用較明顯的Tween-80和β-環(huán)化糊精組合，25-（OH）D3的產(chǎn)率達(dá)14.0mg/L左右。并優(yōu)化其使用濃度、作用溫度、pH、轉(zhuǎn)化和添加時間等反應(yīng)條件：培養(yǎng)3d后添加0.04% Tween-80、0.5% β-環(huán)化糊精和VD3，pH為7.0，28℃，180r/min，發(fā)酵轉(zhuǎn)化反應(yīng)7d。在此條件下，25-（OH）D3產(chǎn)率達(dá)14.5mg/L，約為未添加Tween-80和β-環(huán)化糊精的對照組的300%，顯著提高了該菌株的羥基化效率。

利用微生物轉(zhuǎn)化維生素D3生產(chǎn)活性維生素D3具有條件溫和、污染少、提純方便等優(yōu)勢，但由于菌體酶活力、底物的溶解性和細(xì)胞膜壁等限制，效率不高，現(xiàn)階段與實際應(yīng)用尚有一段距離。而通過添加表面活性劑Tween-80以促進(jìn)菌體膜壁運輸、β-環(huán)化糊精與底物形成復(fù)合物，探討發(fā)酵條件等方面，是一種有效的選擇。而有表面活性劑和β-環(huán)化糊精單獨和共同作用的機理也尚未清楚，有必要進(jìn)一步做詳細(xì)研究。

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