范麗麗，李培，丁洪流，金萍，傅春玲，*

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215128）

食品的質(zhì)量和安全一直是社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，隨著人們生活水平的提高，肉制品消費(fèi)已經(jīng)成為食品消費(fèi)的主流[1]，要確保廣大消費(fèi)者的切身利益，就要保證各種肉制品質(zhì)量可靠。目前利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費(fèi)者而牟取暴利的事件屢屢出現(xiàn)[2]，不僅擾亂市場(chǎng)秩序，還給消費(fèi)者的身心健康帶來(lái)許多負(fù)面影響。近年來(lái)，隨著肉制品食用量的增長(zhǎng)，人們對(duì)肉品質(zhì)量提出了更高的要求。由于加工肉品成分復(fù)雜，摻雜物質(zhì)種類繁多，通常很難用一般的化學(xué)方法鑒別真?zhèn)蝃3-4]，故亟待一種快速準(zhǔn)確的方法來(lái)鑒別肉類摻假。改革開(kāi)放以來(lái)，我國(guó)居民牛肉的消費(fèi)量持續(xù)增加[5]，它為人們提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)人的生長(zhǎng)發(fā)育、提高機(jī)體的免疫力等都具有重要的作用；同時(shí)若牛肉食品中摻入相對(duì)廉價(jià)的豬肉，冒犯了具有伊斯蘭教等宗教信仰的消費(fèi)者，也不利于社會(huì)和諧安定。因此，建立快速鑒別牛肉方法具有十分重要的意義。本文旨在利用Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立一種快速、準(zhǔn)確、可靠的定性牛源性成分的方法，以滿足當(dāng)前的相關(guān)食品摻假檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

各種含牛肉成分的市售加工食品，如清真腸、兒童牛肉酥、鹵牛肉和撒尿肉丸等，以及鮮牛、豬、羊、雞、鴨肉等通過(guò)形態(tài)鑒別 分別購(gòu)自蘇州各大型超市；組織基因組DNA提取試劑盒 購(gòu)自天根生化科技有限公司；無(wú)水乙醇 分析純；Taqman Universal PCR master mix 購(gòu)自ABI。

表1 引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probe

5810型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、生物分光光度計(jì)德國(guó)Eppendorf公司；7000型實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)ABI公司；DKB-1915型恒溫水浴槽 IO-RAD公司；渦旋振蕩器，研缽。

1.2 樣品均質(zhì)及基因組模板制備

采用研缽等實(shí)驗(yàn)器具對(duì)純豬、牛、羊、雞和鴨烘干（105℃）后進(jìn)行均質(zhì)處理，作為特異性及靈敏性實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)純品，以及制作后期模擬混合樣使用，均質(zhì)過(guò)程不同肉類分開(kāi)處理，防止不同動(dòng)物源性污染。按照組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，最終提取OD260/OD280比值均在1.6～2.0之間的動(dòng)物組織DNA。

1.3 引物、探針的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)Genbank所公布的牛線粒體細(xì)胞色素b（Cyt b）基因序列，利用primer express 2.0軟件，依據(jù)引物探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)牛特異性引物和探針，GeneBank Accession：HQ184045.1，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為91bp。引物探針序列見(jiàn)表1。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

反應(yīng)體系的體積為25μL：Taqman PCR master mix；上、下游引物，熒光標(biāo)記探針，各1μL，終濃度皆為0.4μmol/L；模板DNA（0.001～50ng/μL）1μL；其余不足用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40個(gè)循環(huán)。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)

以牛、豬、羊及雞、鴨等純?nèi)馓崛〉腄NA，濃度50ng/μL，各取1μL，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證所設(shè)計(jì)牛引物、探針的特異性。

1.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

取純牛肉提取DNA，用滅菌雙蒸水10倍倍比稀釋，濃度10～0.001ng/μL，取1μL為模板，各濃度3個(gè)平行，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，檢測(cè)所設(shè)計(jì)牛引物、探針的靈敏度，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證。

1.7 模擬樣品中牛源性成分檢測(cè)

為進(jìn)一步檢測(cè)牛特異性引物探針體系，制備不同模擬混合樣品，其中A類模擬樣為牛、豬肉混合樣品，B類為牛、羊肉混合樣品，C類為牛、雞混合樣品，D類為牛、鴨肉混合樣品，E類為牛、豬、羊、雞及鴨五種純?nèi)饣旌暇鶆蚝蟮臉悠?，各肉種在混合樣中依次所占的質(zhì)量百分比見(jiàn)表2。之后每個(gè)混合樣提取DNA模板，各3個(gè)平行進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，以檢驗(yàn)該引物探針體系用于模擬混合樣品的檢測(cè)限。

2 結(jié)果與分析

表2 模擬混合肉類樣品（w/w）Table 2 Samples of meat mixture（w/w）

2.1 引物有效性驗(yàn)證

利用所設(shè)計(jì)的引物，對(duì)牛模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖1中為四個(gè)重復(fù)樣品，由圖1可以看出，皆擴(kuò)增出約91bp的DNA片段，與預(yù)期所設(shè)計(jì)目的片段長(zhǎng)度相符。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

為防止肉類食品中復(fù)雜成分可能抑制PCR擴(kuò)增，將各種肉類DNA模板含量控制在50ng進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)[6]。如圖2所示，所設(shè)計(jì)牛的引物探針體系只針對(duì)牛源性模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，Ct值達(dá)到22，且重復(fù)性良好，對(duì)其他動(dòng)物源性成分，豬、羊、雞、鴨等肉類DNA均不能擴(kuò)增，后者分別用豬、羊、雞、鴨的種特異性引物探針體系均可得到特異性擴(kuò)增，可排除因DNA提取質(zhì)量差或PCR抑制物所致假陰性結(jié)果（另文發(fā)表），證實(shí)該檢測(cè)體系具有很好的特異性。ZHANG Chun-Lai[7]以牛線粒體細(xì)胞色素基因作為靶基因設(shè)計(jì)的檢測(cè)牛DNA的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR的引物探針體系對(duì)豬、羊、火雞、雞等肉類樣品無(wú)交叉反應(yīng)，本文建立牛引物探針體系也顯示對(duì)豬、羊、雞、鴨肉類DNA無(wú)交叉擴(kuò)增，可以滿足市售肉類牛源性檢測(cè)特異性要求。

圖2 牛源性引物探針體系特異性檢測(cè)Fig.2 The specificity detections of bovine primer-probe system

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證該體系的靈敏度，將牛DNA模板10倍倍比稀釋，圖3中牛DNA模板濃度依次為10、1、0.1、0.01、0.001ng/μL，其Ct值范圍為18.12～32.18，且各濃度重復(fù)性好。其中濃度0.001ng/μL的模板亦獲得正常擴(kuò)增，可見(jiàn)該引物探針體系可檢測(cè)到1pg的牛DNA。

圖3 牛源性引物探針體系靈敏性檢測(cè)Fig.3 The sensitivity detections of bovine primer-probe system

2.4 模擬混合樣品中牛源性成分檢測(cè)

用所建立的牛源性特異引物探針體系，對(duì)五類模擬混合肉質(zhì)樣品（如表2）進(jìn)行檢測(cè)，所有含5%～0.5%的牛肉樣品均獲得成功擴(kuò)增，Ct值范圍為21.96～28.03，可知該檢測(cè)體系的檢測(cè)限可低至0.5%以下。因?yàn)槟康腄NA含量愈高，Ct值越小。擴(kuò)增結(jié)果如表4，四種類模擬混合樣品的擴(kuò)增結(jié)果皆呈現(xiàn)隨牛肉成分含量降低，Ct呈增高趨勢(shì)。

2.5 食品樣品中牛源成分檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證牛引物探針體系的準(zhǔn)確性和實(shí)際應(yīng)用能力，對(duì)購(gòu)自市場(chǎng)的食品進(jìn)行檢測(cè)。各食品樣品主要成分分別為清真腸：牛肉、玉米淀粉、食用大豆蛋白、食品添加劑；兒童牛肉酥：牛肉酥、鹽、糖；鹵牛肉：牛肉、食品添加劑等；速凍撒尿牛丸：牛肉、豬肉及雞肉等。四類食品各做三個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增結(jié)果如圖4，自左至右四組曲線依次為清真腸、牛肉酥、鹵牛肉和撒尿牛丸，皆獲得正常擴(kuò)增，表明該體系可檢測(cè)加工肉食品中所存在的牛肉成分。

表3 模擬混合肉樣中牛源性成分的檢測(cè)Table 3 Detections of bovine in meat mixtures

圖4 食品樣品牛源成分檢測(cè)Fig.4 Detections of bovine in food samples

3 討論

國(guó)內(nèi)已經(jīng)建立的食品肉種的檢測(cè)方法存在一些應(yīng)用方面的缺陷，如趙紅波等[8]所建立的紅外光譜技術(shù)以及田金輝等[9]的T-RFLP鑒定方法目前僅針對(duì)于生鮮肉，尚無(wú)法應(yīng)用于熟牛肉以及混合肉樣食品的檢測(cè)。而孫艷華等[10]建立的普通PCR檢測(cè)熟肉肉類來(lái)源的方法檢測(cè)限為5%，靈敏性不高，同時(shí)存在耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)物易污染、不能批量檢測(cè)等問(wèn)題[11]。Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在檢測(cè)食品種源方面具有優(yōu)勢(shì)：其特異性有引物和探針雙重保障，可避免假陽(yáng)性；擴(kuò)增片段短（約100bp）不受高度加工食品DNA降解的影響；而且靈敏度高、定量準(zhǔn)確，可快速、自動(dòng)化、批量檢測(cè)，特別適合于成分復(fù)雜的加工食品種源檢測(cè)。本文利用Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立的牛源檢測(cè)體系通過(guò)針對(duì)牛線粒體細(xì)胞色素b基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，可特異檢測(cè)牛源成分，而不受市售常見(jiàn)豬、羊、雞鴨等肉類種源的影響，檢測(cè)特異性較高；將陽(yáng)性檢測(cè)限設(shè)定在CT設(shè)定在35循環(huán)以內(nèi)，也獲得了較高的靈敏性，可檢測(cè)1pg牛源DNA的存在；對(duì)于含5%～0.5%牛肉的不同類型模擬混合肉樣，均可準(zhǔn)確測(cè)定而不受其他種源肉的干擾。國(guó)外所利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行肉類種源鑒定的研究中，Jonker等[12]選取牛satellite IV一段序列設(shè)計(jì)引物探針，最低僅可檢測(cè)0.2ng牛DNA；Dooly等[6]同樣以線粒體細(xì)胞色素b基因?yàn)槟康幕?，其所建立的牛源檢測(cè)體系由于與其他肉種存在一定的交叉反應(yīng)，為滿足特異性需要，其CT限定在30循環(huán)以內(nèi)，如此便限制了該體系的靈敏度。Camma等[13]以cyt b基因作為目的基因建立的牛源引物探針體系可檢測(cè)0.8pg模板DNA，與本研究相近；但對(duì)于混合肉樣的檢測(cè)限僅達(dá)1%（CT值為27.78），高于本檢測(cè)體系的檢測(cè)限0.5%。因此相比國(guó)外已經(jīng)建立的方法，本文建立的牛源檢測(cè)體系在特異性、靈敏性上具有一定的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)經(jīng)對(duì)市售樣品的應(yīng)用性檢測(cè)，可特異的檢測(cè)出各種加工食品，如火腿腸、肉丸中的牛源成分，驗(yàn)證了該檢測(cè)體系應(yīng)用性較好。

本研究建立的食品中牛源性成分檢測(cè)體系經(jīng)驗(yàn)證具有較好的特異性和高靈敏度，以及很好的市場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用能力，具有準(zhǔn)確、省時(shí)等特點(diǎn)，可作為市售食品中牛源成分檢測(cè)的有效手段。

[1] 張兵，王惠君，杜文雯，等. 1989—2006年中國(guó)九省（區(qū)）居民食物消費(fèi)狀況[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45（4）：330-334.

[2] 韋公遠(yuǎn). 市場(chǎng)上常見(jiàn)肉品的鑒別[J]. 肉類研究，2003，17（3）：36，43.

[3] 高琳，徐幸蓮，周光宏. PCR技術(shù)用于食品中原料肉物種鑒別的研究進(jìn)展[J]. 肉類研究，2006，20（10）：19-21，31.

[4] Arana A，Soret B，Lasa L，et al. Meat traceability using DNA markers：application to the beef industry[J]. Meat Science，2002，61（4）：367-373.

[5] 李建. 中國(guó)牛肉消費(fèi)特征及其影響因素研究[M]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[6] Dooly JJ，Paine KE，Garrett SD，et al. Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays[J]. Meat Science，2004，68（3）：431-438.

[7] Zhang CL，F(xiàn)owler MR，Scott NW，et al. A TaqMan real-time PCR system for the identification and quantification of bovine DNA in meats，milks and cheeses[J]. Food Control，2007，18（9）：1149-1158.

[8] 趙紅波，譚紅，史會(huì)兵，等. 近紅外光譜技術(shù)鑒別豬肉和牛肉的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（26）：151-155.

[9] 田金輝，李寶明，尉婷媛，等. T-RFLP快速鑒定生鮮肉中牛羊成分的研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（3）：84-86.

[10] 孫艷華，張智禹，牛晉陽(yáng)，等. PCR法快速檢測(cè)熟肉制品中肉類來(lái)源[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2010，31（5）：139-142.

[11] 高丹丹，曹郁生，王迎華. PCR技術(shù)在食品動(dòng)物源性檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28（1）：141-144.

[12] Jongker KM，Tilburg JJ，Hagele GH，et al. Species identification in meat products using real-time PCR[J]. Food Additive Contaminants，2008，25（5）：527-533.

[13] Camma C，Domenico MD，Monaco F. Development and validation of fast Real-Time PCR assay for species identification in raw and cooked meat mixtures[J]. Food Control，2012，23（2）：400-404.