肖恒，王海霞，陶崑，劉鑫，鐘梁，黃世峰，馮文莉

CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在K562細胞中的定位及其與BCR-ABL蛋白的相互作用

肖恒，王海霞，陶崑，劉鑫，鐘梁，黃世峰，馮文莉

目的研究CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA兩種融合肽在慢性粒細胞白血病(CML)K562細胞中的定位及其與BCR-ABL蛋白的相互作用。方法將前期制備的CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽轉(zhuǎn)導(dǎo)入K562細胞，采用免疫熒光和Western blotting方法檢測其入胞情況及胞內(nèi)定位，His-pull down和CoIP實驗檢測融合肽與BCR-ABL的相互作用。結(jié)果免疫熒光檢測顯示CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均能穿過細胞膜進入細胞并定位于胞質(zhì)，Western blotting也同時檢測到進入細胞質(zhì)中的兩種融合肽。His-pull down實驗結(jié)果表明，CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在細胞外均可直接與BCR-ABL蛋白結(jié)合，CoIP實驗結(jié)果顯示兩種融合肽在K562細胞內(nèi)也能與BCR-ABL蛋白結(jié)合并形成復(fù)合物。結(jié)論CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均能成功進入白血病K562細胞并定位于細胞質(zhì)，且可與BCR-ABL蛋白發(fā)生相互作用。

白血病，粒-單核細胞，慢性；融合蛋白質(zhì)類，bcr-abl

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種以形成BCR-ABL融合基因為特征的造血干細胞惡性克隆增殖性疾病[1-2]，其表達生成的BCR-ABL癌蛋白可使ABL激酶持續(xù)活化，從而導(dǎo)致CML的發(fā)生。目前，CML的主要治療藥物為伊馬替尼，但近年來耐藥情況日益嚴(yán)重[3-5]，因此，迫切需要尋找新的治療靶點。寡聚化結(jié)構(gòu)域(oligomerization domain，OD)是位于BCR-ABL蛋白N端的重要結(jié)構(gòu)域，由72個氨基酸構(gòu)成，即BCR1-72。有研究證實可通過靶向該OD域達到治療CML的目的[6-8]。近來有報道指出，OD域中起關(guān)鍵作用的是第30–63位氨基酸[9]。因此，本課題組前期分別制備了含BCR30-63的CTP-OD2-HA融合肽和含BCR1-29+64-72的CTP-OD1-HA融合肽。本研究以含BCR1-72的CTP-OD-HA融合肽為陽性對照，不含BCR1-72的CTP-HA融合肽及PBS為陰性對照，檢測上述兩種融合肽的入胞能力及定位，并研究其在胞外和胞內(nèi)與BCR-ABL蛋白的相互作用，為后續(xù)檢測其生物學(xué)效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 細胞培養(yǎng)所需胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液干粉購自美國Gibco公司，鼠抗HA抗體、兔抗c-ABL抗體購自美國Cell Signal公司，山羊抗鼠Cy3抗體、DAPI染料購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CoIP試劑盒購自美國Thermo公司，Ni-NTA His純化柱購自德國QIAGEN公司，正常山羊血清封閉液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細胞株及融合肽 慢性粒細胞白血病急變細胞株K562細胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室保存，能穩(wěn)定表達BCR-ABL融合蛋白。CTP-OD1-HA、CTP-OD2-HA、CTP-OD-HA和CTP-HA融合肽由本課題組前期表達純化獲得。

1.3 細胞免疫熒光檢測融合肽入胞情況 將K562細胞常規(guī)換液，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。在無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中分別加入終濃度為4μmol/L的CTP-OD-HA、CTP-OD1-HA、CTP-OD2-HA、CTP-HA融合肽和PBS，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6h。離心收集細胞后，涂片、干燥、固定，先后孵育鼠抗-HA抗體(1:1000稀釋)和Cy3標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(1:1000稀釋)，并進行DAPI復(fù)染，封片觀察結(jié)果。

1.4 Western blotting檢測融合肽入胞情況 為了證明CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽可以在細胞中與BCR-ABL相互結(jié)合，并排除其結(jié)合能力的差異不是由融合肽進入細胞的量所造成的差異，實驗設(shè)計如下：K562細胞培養(yǎng)同上，在含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中分別加入終濃度為60μmol/L的CTP-OD-HA、CTP-OD1-HA、CTP-OD2-HA、CTPHA融合肽和PBS，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。離心收集細胞，提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳進行分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉后孵育鼠抗HA多克隆抗體(1:1000稀釋)和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1:1000稀釋)，化學(xué)發(fā)光顯影，以檢測各融合蛋白進入細胞的含量是否一致。

1.5 His-pull down檢測CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA與BCR-ABL蛋白的相互作用 離心收集對數(shù)生長期的K562細胞，提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，并均分成4份。將提取的蛋白與預(yù)先結(jié)合了融合肽的Ni-NTA His純化柱混合，4℃緩慢結(jié)合約1h，漂洗后進行洗脫，并留取洗脫液。以不加蛋白提取液的Ni-NTA His純化柱作為原核表達融合肽陽性對照，不加Ni-NTA His純化柱的蛋白提取液作為BCR-ABL融合蛋白陽性對照，兩種對照處理方法同上。Western blotting檢測上述洗脫液中的融合肽和BCR-ABL融合蛋白。

1.6 CoIP檢測細胞內(nèi)CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA與BCR-ABL蛋白的相互作用 在K562細胞中分別加入終濃度為60μmol/L的CTP-OD-HA、CTPOD1-HA、CTP-OD2-HA、CTP-HA融合肽和PBS，于37℃、5%CO2條件下孵育24h。離心收集細胞，使用CoIP試劑盒內(nèi)的非變性蛋白裂解液提取蛋白，并加入PMSF防止蛋白降解，Bradford法測定蛋白濃度。將蛋白提取液與CoIP試劑盒內(nèi)抗HA抗體的瓊脂糖磁珠充分混勻，4℃攪拌過夜。離心棄上清，將瓊脂糖磁珠用PBS洗滌后，加入CoIP試劑盒中的2×上樣緩沖液，沸水煮5min。Western blotting檢測融合肽和BCR-ABL融合蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 免疫熒光檢測融合肽入胞情況 K562細胞分別經(jīng)CTP-OD1-HA、CTP-OD2-HA融合肽及CTPOD-HA、CTP-HA處理后，熒光顯微鏡觀察可見，被Cy3標(biāo)記的紅色熒光主要出現(xiàn)在胞質(zhì)內(nèi)，細胞核被DAPI染為藍色，而PBS組僅見DAPI的藍色熒光(圖1)。由此可見融合肽可以穿過細胞膜進入細胞，并定位于胞質(zhì)中。

2.2 Western blotting檢測融合肽入胞情況 Western blotting結(jié)果顯示，4種融合肽蛋白條帶與β-actin的比值無明顯差異(圖2)，即進入細胞的含量相同。

2.3 His-pull down檢測細胞外融合肽與BCR-ABL蛋白的相互作用 與陽性對照融合肽CTP-OD-HA相比，BCR-ABL融合蛋白均可以被融合肽CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA“pull down”。CTP-HA中由于不含OD域中的任何結(jié)構(gòu)，因此，沒有BCR-ABL可以被“pull down”(圖3)。以上結(jié)果說明CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均可與BCR-ABL蛋白結(jié)合。

圖2 Western blotting檢測K562細胞中融合肽的含量Fig.2 Contents of fusion peptides in K562 cells detected by Western blotting

圖3 His-pull down檢測融合肽與BCR-ABL的相互作用Fig.3 Interaction of BCR-ABL with fusion peptides detected by His-pull down assay

2.4 CoIP檢測細胞內(nèi)融合肽與BCR-ABL蛋白的相互作用 K562細胞內(nèi)分別加入融合肽CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA后，融合肽均可與BCR-ABL結(jié)合。與陽性對照CTP-OD-HA相比，兩種融合肽的結(jié)合能力較弱，CTP-OD1-HA的結(jié)合力強于CTP-OD2-HA(圖4)。

3 討 論

圖4 CoIP檢測K562細胞內(nèi)融合肽與BCR-ABL的相互作用Fig.4 Detection of interaction of fusion peptides with BCRABL in K562 cells by CoIP assay

CML是由于BCR-ABL融合蛋白形成導(dǎo)致酪氨酸激酶異?；罨?，從而引起骨髓造血干細胞惡性增殖的疾病[10]。深入研究BCR-ABL的結(jié)構(gòu)有利于開發(fā)新的治療CML的小分子藥物[11]。研究顯示，可通過蛋白-蛋白之間的相互作用篩選出具有高親和力、高穩(wěn)定性的小分子多肽或小分子化合物作為治療疾病的小分子藥物的前體[12]，同時研究蛋白-蛋白的相互作用也是對小分子蛋白進行修飾的前提條件[13]。Pull down和CoIP實驗作為研究蛋白-蛋白相互作用的常用研究方法，可以確定蛋白相互作用的氨基酸區(qū)域[14]，其中Pull down實驗可以在細胞外研究蛋白-蛋白之間的相互作用，而其在活細胞內(nèi)的相互作用則通過CoIP實驗進行驗證。

從BCR1-72晶體結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，BCR30-63在BCR1-72四聚體化后對BCR-ABL激酶的活化中起重要作用，但仍未有實驗數(shù)據(jù)進行驗證，除BCR30-63以外，BCR1-29+64-72是否有生物學(xué)功能也仍不清楚。本實驗通過Pull down和CoIP兩種方法探討CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽與BCR-ABL之間的相互關(guān)系，結(jié)果表明兩種融合肽均可通過信號肽CTP的作用進入K562細胞并定位于胞質(zhì)，且無論在胞外還是胞內(nèi)，二者均可與BCR-ABL結(jié)合，但是CTP-OD1-HA與BCR-ABL蛋白的親和力強于CTP-OD2-HA，可能是由于OD1和OD2與BCR-ABL結(jié)合的部位不同、空間位阻不同所致。

綜上所述，本實驗驗證了通過大腸埃希菌表達的融合肽CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA可成功跨膜入胞，定位于胞質(zhì)，并可與BCR-ABL蛋白相結(jié)合，為后續(xù)深入研究兩種融合肽的生物學(xué)功能和分子機制奠定了基礎(chǔ)。

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Location of CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA fusion peptide in K562 cells and its interaction with BCR-ABL protein

XIAO Heng, WANG Hai-xia, TAO Kun, LIU Xin, ZHONG Liang, HUANG Shi-feng, FENG Wen-li*
Department of Clinical Hematology, Key Laboratory of Laboratory Medical of Education Ministry, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
*

, E-mail: fengwlcqmu@sina.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30670901, 30871102)

ObjectiveTo investigate the intracellular location of cytoplasmic transduction peptide-oligomerization domain 1-hemagglutinin (CTP-OD1-HA) and cytoplasmic transduction peptide-oligomerization domain 2-hemagglutinin (CTP-OD2-HA) fusion peptide and interaction with BCR-ABL protein in chronic myelocytic leukemia (CML) K562 cells.MethodsThe prepared CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA fusion peptide were transduced into K562 cells, and the cytoplasmic transduction peptideoligomerization domain-hemagglutinin (CTP-OD-HA) peptide was used as positive control, and cytoplasmic transduction peptidehemagglutinin (CTP-HA) and PBS were used as negative control. The intracellular location of the fusion peptide was demonstrated by immunofluorescence and Western blotting. The interactions between the fusion peptides and BCR-ABL protein were detected by His-pull down and CoIP test.ResultsImmunofluorescence assay showed that both fusion peptides CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA could penetrate the cell membrane, and they were mainly localized in cytoplasm. Western blotting also confirmed the existence of the two fusion peptides in the cytoplasm. His-pull down showed that CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA could directly bind BCRABL protein outside the cells, and CoIP experiment showed that both fusion peptides could interact with BCR-ABL protein and form complex in the K562 cells. The negative control CTP-HA fusion peptide and PBS showed no such effects.ConclusionCTPOD1-HA and CTP-OD2-HA fusion peptides can successfully target into CML K562 cells and locate in cytoplasm, and it interacts with BCR-ABL protein.

leukemia, myelomonocytic, chronic; fusion proteins, bcr-abl

R733.7

A

0577-7402(2013)11-0896-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.11.006

2013-07-03；

2013-09-11)

(責(zé)任編輯：李恩江)

國家自然科學(xué)基金(30670901、30871102)

肖恒，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事白血病的分子機制及基因治療研究

400016 重慶 重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室(肖恒、王海霞、陶崑、劉鑫、鐘梁、黃世峰、馮文莉)

馮文莉，E-mail: fengwlcqmu@sina.com