余 瑛，汪雅琴，張孝彬，衛(wèi)澤峰

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

綠膿桿菌(pseudomonas aeruginosa，PA)為人類三大機會致病菌之一，對機體免疫功能低下人群有強致病性。近年來該菌的臨床感染率逐年增高，且耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使得感染后的治療越來越困難?？咕鞍?或抗菌肽)是一類普遍存在于生物體內的陽離子多肽，具有抗菌譜廣、作用強、起效快、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點［1］，已日益引起廣泛關注，成為一類極具開發(fā)潛力的新型抗感染制劑。本研究從土壤微生物中篩選出一株拮抗PA的菌株，并對其活性成分進行分離和鑒定，為將來進行新型抗PA藥物研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1)供試菌株。PA標準菌株PA01，由第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院惠贈。

2)土壤樣品。取自第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院周邊土壤。

3)培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10%，酵母膏5%，NaCl 10%，pH值為7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母膏3%，胰蛋白胨5%，葡萄糖3%，NaCl 5%，pH值為7.2。抑菌平板培養(yǎng)基:瓊脂1%，胰蛋白胨 2.5%，酵母膏 1.3%，NaCl 2.5%，pH 值為7.2。篩選培養(yǎng)基:胰蛋白胨5%，酵母膏2.5%，NaCl 5%，瓊脂1%，pH 值為7.2。

4)主要試劑。寬分子量蛋白Marker(TaKa-Ra);柱式小量細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海華舜生物技術有限公司生產(chǎn));16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(TaKaRa)Sephadex G－100(Rharmacia)。

1.2 方法

1)土壤的采集。采用多點取樣法采集醫(yī)院周邊土壤，取回后于4℃保存。

2)拮抗PA的菌株的分離采用雙層平板法。取過夜培養(yǎng)的PA01 1 mL與50℃篩選培養(yǎng)基混勻，倒入平板自然冷卻，待其凝固即制成下層培養(yǎng)基。將土壤樣品充分研磨，靜置1 h后取上清。對土壤上清進行梯度稀釋，取1 mL與50℃篩選培養(yǎng)基混勻，倒入冷卻的下層培養(yǎng)基上，待其自然冷卻凝固即制成雙層培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)，觀察是否有抑菌圈形成。

用滅菌牙簽挑取在雙層平板上產(chǎn)生透明抑菌圈的菌落，點接到新的雙層平板上，37℃培養(yǎng)3 d，觀察其是否再次產(chǎn)生抑菌圈。將再次產(chǎn)生抑菌圈的菌株在LB平板上進行劃線培養(yǎng)，連續(xù)繼代3次純化菌種并保存。

3)拮抗PA的菌株鑒定采用形態(tài)學方法和16SrDNA分析法。形態(tài)學觀察包括對分離菌株在LB平板上的菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色［2］觀察。16S rDNA分析方法如下:從平板上挑取分離菌株的單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，250 r/min過夜培養(yǎng)。次日收集菌體，按照柱式小量細菌基因組DNA抽提試劑盒的說明提取其基因組DNA。以基因組DNA為模板，采用16S rDNA Bacterial I-dentification PCR Kit擴增16S rDNA，擴增產(chǎn)物交上海博尚生物有限公司進行測序。對測序結果進行BLAST和RDB分析。

4)拮抗PA活性的測定參照A.Berger［1］的方法，并做如下改進:在直徑100 mm的平板中加入50 mL 50℃左右的抑菌平板培養(yǎng)基，待冷卻后，在其上均勻涂布100 μLPA菌懸液。用打孔器在指示平板上打直徑9 mm的孔，加入發(fā)酵液或目標蛋白，37℃孵育24 h，觀察并測量抑菌圈大小。

5)分離菌的發(fā)酵培養(yǎng)及拮抗PA抗菌蛋白的分離。挑取分離菌株的單克隆，接種100 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，250 r/min培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)液按體積比1∶100接種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵48 h后離心收集上清。用飽和度為30%和60%的硫酸銨分步沉淀發(fā)酵上清，棄30%硫酸銨沉淀物。60%的硫酸銨沉淀后，離心收集沉淀。用 pH值為7.4，50 mmol/L的Tris-HCl按體積比1:1溶解沉淀，然后轉入Sephadex G－100層析柱進行分離，流速為3 mL/min。用OD280檢測，收集各吸收峰的流出液，并測定其抗PA活性。SDS-PAGE電泳［3］測定各吸收峰蛋白質分子量。

6)進行拮抗PA抗菌蛋白的特性分析。①高溫耐受性分析:稀釋活性峰流出液至50 μg/mL，各取 100 μL，分別于 4℃、37℃、45℃、65℃、100℃處理15 min，測定其抗PA活性。② 蛋白酶K的敏感性分析:稀釋活性峰流出液至50 μg/mL，各取 100 μL加入 l mg/mL蛋白酶 K，37℃ 溫育30 min，測定其抗PA活性。

2 結果與分析

2.1 拮抗PA的菌株篩選與鑒定結果

采用篩選培養(yǎng)基篩選、分離出菌株 B105。B105在LB固體平板上菌落呈現(xiàn)乳白色，半透明，圓形，中間凸起(見圖1(a))。革蘭氏染色陰性，菌體長1.2 ×1.0 μm，為短桿菌(見圖 1(b))。

圖1 B105的形態(tài)特征

以提取的各分離菌的基因組DNA為模板，分別采用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit中的引物 P1、P2和 P1、P3擴增16S rDNA。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳。結果顯示，擴增產(chǎn)物大小與預期大小一致(見圖2)，P1、P2擴增產(chǎn)物為500 bp，P1、P3擴增產(chǎn)物為1 500 bp。

圖2 16S rDNA擴增結果

16S rDNA擴增產(chǎn)物測序后，經(jīng)BLAST比對及RDB分析，得出B105與Acinetobacter Iwoffii DSM 2403高度同源，同源性達99%，即 B105屬于Acinetobacter(不動桿菌屬)。

2.2 B105的發(fā)酵培養(yǎng)與拮抗PA活性成分的分離

將B105進行發(fā)酵培養(yǎng)后，離心收集發(fā)酵液。用飽和度為30%、60%的硫酸銨分步沉淀發(fā)酵上清。30%硫酸銨沉淀棄去，60%的硫酸銨沉淀用pH值為7.4的Tris-HC溶解后，采用G100層析柱進行分離，紫外檢測顯示流出液有2個主吸收峰。采用SDS-PAGE檢測得出2個主吸收峰分離出的蛋白相對分子量約為50KD(峰1)和35KD(峰2)(見圖3)?？筆A活性測定表明第2個主吸收峰流出液有拮抗PA活性。將第2個吸收峰流出液收集用于高溫耐受性和蛋白酶K敏感性分析。

圖3 SDS-PAGE電泳測定B105抗菌蛋白的分子量

2.3 B105拮抗PA的活性成分的特性分析

取上述第2個吸收峰流出液稀釋液100 μL，分別用4℃、45℃、65℃、100℃處理測定其拮抗PA的活性。抑菌活性測定結果顯示，B105產(chǎn)生的抗菌蛋白在經(jīng)45℃以上高溫處理后抑菌環(huán)直徑變小甚至喪失(見圖4)。該結果提示B105產(chǎn)生的抗菌蛋白抗菌活性不穩(wěn)定，45℃以上高溫可破壞其抗PA活性。

取上述第2個吸收峰流出液稀釋液100μL，用蛋白酶K處理后進行抑菌活性測定，結果顯示其抑菌活性顯著降低(見圖5)。該結果提示B105拮抗PA的活性成分對蛋白酶K敏感。

圖4 B105抗菌蛋白的高溫耐受性測定

圖5 B105拮抗PA的活性成分的蛋白酶K敏感性測定

3 討論

PA廣泛存在于自然界中，也分布于正常人的皮膚、呼吸道和腸道等與外界相通的腔道中，特別是在呼吸道中定植菌或感染菌最為常見，當機體免疫功能下降時，易發(fā)生感染。據(jù)文獻報告，綠膿桿菌感染主要發(fā)生于重癥監(jiān)護室、呼吸科、腫瘤科與老年病科。臨床上以肺炎、敗血癥、腹腔炎癥、燒傷、膿毒癥、尿路感染最為常見，其中綠膿桿菌肺炎病死率高達30%以上，綠膿桿菌敗血癥的病死率達80%以上［4］。研究發(fā)現(xiàn)PA具有多種針對抗生素的耐藥機制［5］，耐藥菌株不斷增多使得抗PA感染治療藥物日益匱乏，尋找新型抗PA藥物已刻不容緩?？咕鞍谆蚩咕牡目咕鷻C制與抗生素完全不同，不易產(chǎn)生抗藥性，是理想的替代抗生素的新型抗感染藥物候選分子。在適當抑菌濃度下，抗菌蛋白或抗菌肽能在體內以直接殺死病原菌的方式起作用，與生物膜組成成分或胞內細胞器等多種微生物靶位相互作用，破壞其完整性，干擾細胞正常代謝活動，導致細菌死亡?？咕鞍谆蚩咕耐瑯右部梢宰鳛槊庖咝肿觼韱?、調節(jié)宿主免疫體系，促進免疫功能，從而消除感染，保護宿主免受病原微生物傷害［6－8］。然而，天然抗菌蛋白或抗菌肽作為藥物使用也存在不足，如具有抗菌活性不穩(wěn)定、進入體內后易被蛋白酶水解等普遍問題。本項目篩選出的不動桿菌產(chǎn)生的抗菌蛋白具有很好的抗PA活性，是進行抗PA藥物研發(fā)的理想的候選分子，但它在高溫或蛋白酶K處理后抗PA活性容易喪失，還需要進行結構修飾、改造等相關研究來增強其抗菌活性的穩(wěn)定性及提高其抗水解能力，以延長其半衰期。

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