趙巖，李聞

（中國人民解放軍總醫(yī)院消化科，北京100853）

·論著·

膽汁內(nèi)、外引流術(shù)對(duì)梗阻性黃疸大鼠小腸黏膜巨噬細(xì)胞和TNF-α表達(dá)的影響

趙巖，李聞

（中國人民解放軍總醫(yī)院消化科，北京100853）

目的探討膽汁內(nèi)、外引流術(shù)對(duì)梗阻性黃疸大鼠腸黏膜巨噬細(xì)胞及腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)的影響。方法將60只體重300～350 g的成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組：梗阻性黃疸組(OJ)、膽汁外引流組(ED)、膽汁內(nèi)引流組(ID)及假手術(shù)對(duì)照組(SH)。于二次術(shù)后第7天留取末端回腸標(biāo)本。應(yīng)用免疫組化染色測(cè)定大鼠腸黏膜CD68及TNF-α表達(dá)的變化。結(jié)果四組大鼠模型均成功建立。梗黃時(shí)大鼠腸黏膜CD68及TNF-α的表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)，平均光密度升高[(0.58±0.050)、(0.28±0.034)，P＜0.01；(0.34±0.042)、(0.14± 0.021)，P＜0.01]。黃疸由膽汁內(nèi)引流術(shù)解除后，大鼠腸黏膜CD68的表達(dá)與梗阻性黃疸組相比明顯減少，平均光密度降低[(0.49±0.049)，P＜0.05]；黃疸由膽汁外引流術(shù)解除后，大鼠腸黏膜CD68表達(dá)水平減少，平均光密度降低(0.55±0.076)，與梗黃組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)膽汁內(nèi)外引流術(shù)解除黃疸后，大鼠腸黏膜TNF-α表達(dá)受到抑制，平均光密度均降低[(0.29±0.034)、(0.33±0.030)]，但內(nèi)引流組較梗黃組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)、外引流組差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論梗阻性黃疸時(shí)腸黏膜免疫屏障受損，巨噬細(xì)胞及細(xì)胞因子TNF-α分泌紊亂，膽汁內(nèi)引流術(shù)能顯著降低腸黏膜炎癥因子的分泌，但膽汁外引流術(shù)卻不能改善這一狀況，提示梗阻性黃疸術(shù)前通過膽汁內(nèi)引流術(shù)解除要優(yōu)于膽汁外引流術(shù)。

梗阻性黃疸；膽汁內(nèi)引流術(shù)；膽汁外引流術(shù)；腸黏膜；巨噬細(xì)胞；腫瘤壞死因子α

梗阻性黃疸是臨床常見病、多發(fā)病，目前外科手術(shù)是解除梗黃的最有效方法，然而圍手術(shù)期多臟器損傷的發(fā)生率和病死率并未隨著手術(shù)技術(shù)的提高而顯著下降，其原因除手術(shù)創(chuàng)傷和術(shù)后并發(fā)癥外，與梗阻性黃疸腸黏膜屏障功能受損細(xì)菌移位引發(fā)血內(nèi)毒素血癥緊密相關(guān)。但到目前為止，是否選擇手術(shù)前解除梗阻在外科手術(shù)中的意義仍有爭議，膽汁內(nèi)外引流術(shù)，哪種引流方式更好，迄今仍無統(tǒng)一意見[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過研究膽汁內(nèi)、外引流術(shù)對(duì)梗阻性黃疸大鼠小腸黏膜巨噬細(xì)胞、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)的影響，為梗阻性黃疸患者的臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇成年健康SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量300～350 g，由軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑小鼠抗大鼠CD68抗體(Abcam公司)，兔抗大鼠TNF-α抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，小鼠及兔二步法檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 造模與分組保持環(huán)境溫度15℃～20℃的情況下，將大鼠分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，自由飲食飲水，喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為四組，每組各15只。SH組(假手術(shù)對(duì)照組)：大鼠開腹分離膽總管但并不結(jié)扎，飼養(yǎng)7 d后第二次手術(shù)，分離大鼠膽總管但并不引流，再飼養(yǎng)7 d后處死留取末端回腸標(biāo)本。OJ組(梗阻性黃疸組)：大鼠開腹分離膽總管并結(jié)扎切斷，成功建立大鼠梗阻性黃疸的模型，飼養(yǎng)7 d后二次手術(shù)，開腹分離膽總管但并不引流，7 d后處死留取標(biāo)本。ID組(膽汁內(nèi)引流組)：大鼠梗阻性黃疸模型建立后，飼養(yǎng)7 d行二次手術(shù)，將內(nèi)引流管植入膽總管的末端和十二指腸間，關(guān)腹再飼養(yǎng)7 d后處死留取標(biāo)本。ED組(膽汁外引流組)：梗阻性黃疸模型成功后，飼養(yǎng)7 d二次手術(shù)，將外引流管插入膽管末端，由皮下引至體外頸背部并固定，7 d后處死大鼠并留取標(biāo)本。

1.4 標(biāo)本留取以3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg腹腔內(nèi)注射)進(jìn)行大鼠麻醉，開腹取回腸末端全層標(biāo)本，用冰生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，10%福爾馬林溶液固定，制成石蠟切塊并切片備用。

1.5 免疫組化檢測(cè)腸黏膜CD68及TNF-α的表達(dá)將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS）沖洗3次，然后3%H2O2室溫孵育20 min后，采用高壓鍋水浴進(jìn)行抗原的修復(fù)，自然冷卻，PBS沖洗3次，每次3 min，隨后采用正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min后，以PBS代替一抗作為對(duì)照，滴加一抗，4℃冰箱過夜；再次PBS溶液沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，37℃孵育30 min后，用PBS沖洗3次，每次3 min， DAB顯色，自來水進(jìn)行沖洗，蘇木素復(fù)染，最后常規(guī)梯度酒精進(jìn)行脫水后用常規(guī)樹脂封片。結(jié)果判斷：CD68免疫反應(yīng)陽性主要表達(dá)在胞漿，TNF-α免疫反應(yīng)陽性主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿及胞膜。DAB顯色呈棕黃色至深棕黃色顆粒顯示為陽性。

1.6 免疫組化圖像分析將免疫組化切片與圖像分析系統(tǒng)的顯微鏡相連接(400×)，每1℃張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，應(yīng)用Image Pro Plus軟件測(cè)量CD68及TNF-α平均光密度值(OD)，最后求其平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況結(jié)扎切斷大鼠的膽總管后，大鼠全身毛色發(fā)黃，大小便發(fā)黃，飲食量降低，體重減輕。采用膽汁內(nèi)引流術(shù)解除梗阻后，大鼠飲食及活動(dòng)增加，體重也顯著增加。大鼠行膽汁外引流術(shù)解除梗阻后，可看到大量膽汁經(jīng)外引流管由頸背部排出，但大鼠飲食及活動(dòng)無變化，體重不變或降低。假手術(shù)對(duì)照組大鼠的一般情況無明顯變化。

2.2 各組腸黏膜CD68及TNF-α免疫組化染色結(jié)果鏡下CD68胞漿著棕黃色主要分布在小腸黏膜固有層；與SH組比較，OJ組腸黏膜CD68表達(dá)明顯增多；而與OJ組比較，ED組及ID組腸黏膜CD68表達(dá)均降低，且ID組腸黏膜CD68比ED組降低更加明顯(圖1)。TNF-α免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物主要分布在腸黏膜的巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞的細(xì)胞漿中。與SH組比較，OJ組腸黏膜TNF-α表達(dá)增多；但與OJ組比較，ED組及ID組腸黏膜TNF-α均降低，且ID組降低明顯(圖2)。

圖1 各組腸黏膜CD68表達(dá)情況。

圖2 各組小腸黏膜TNF-α表達(dá)情況

2.3 各組腸黏膜CD68及TNF-α免疫組化染色結(jié)果定量分析梗阻性黃疸形成(OJ組)后，CD68、TNF-α表達(dá)與SH組比較均顯著增加(P＜0.01)。通過膽汁內(nèi)引流術(shù)解除黃疸后，大鼠腸黏膜CD68表達(dá)與梗阻性黃疸組相比顯著減少(P＜0.05)；行膽汁外引流術(shù)解除黃疸后，大鼠腸黏膜CD68受抑制較小，減少程度與梗阻性黃疸組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。通過膽汁內(nèi)、外引流術(shù)解除黃疸，大鼠腸黏膜TNF-α表達(dá)均受到抑制，平均光密度均降低，但與梗阻性黃疸組相比內(nèi)引流顯著降低(P＜0.01)、外引流差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組小腸黏膜CD68、TNF-α表達(dá)情況定量分析見表1。

表1 各組大鼠小腸黏膜CD68及TNF-α表達(dá)情況

表1 各組大鼠小腸黏膜CD68及TNF-α表達(dá)情況

注：與SH組比較，aP＜0.01(F=13.27)，bP＜0.01(F=24.94)；與OJ組比較，cP＜0.05（F=3.98），dP＜0.01（F=6.24）。

組別SH OJ ID ED TNF-α(μg/L) 0.14±0.021 0.34±0.042b0.29±0.034d0.33±0.030例數(shù)15 15 15 15 CD68(個(gè)) 0.28±0.034 0.58±0.050a0.49±0.049c0.55±0.076

3 討論

梗阻性黃疸是臨床常見綜合征，雖然外科手術(shù)和重癥監(jiān)護(hù)手段不斷提高，但圍手術(shù)期并發(fā)癥發(fā)生率和病死率仍居高不下[3]。這與梗阻性黃疸時(shí)肝臟分泌的膽汁不能有效進(jìn)入腸道發(fā)揮生理作用，腸黏膜屏障功能受損，內(nèi)毒素吸收入血引起腸源性內(nèi)毒素血癥密切相關(guān)。

腸黏膜免疫屏障由腸相關(guān)淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue，GALT)和彌散免疫細(xì)胞組成。許多研究指出梗阻性黃疸后，腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平顯著降低[4]，使腸道黏膜清除細(xì)菌與內(nèi)毒素的能力下降，發(fā)生細(xì)菌移位和內(nèi)毒素入血；但關(guān)于梗阻性黃疸時(shí)腸黏膜巨噬細(xì)胞及其分泌因子TNF-α的表達(dá)變化鮮有報(bào)道，亦未見膽汁內(nèi)外引流術(shù)解除梗阻性黃疸對(duì)腸黏膜巨噬細(xì)胞及細(xì)胞因子TNF-α影響的研究。因此本研究主要探討梗阻性黃疸時(shí)，腸黏膜巨噬細(xì)胞及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的變化，及通過膽汁內(nèi)引流術(shù)與外引流術(shù)解除梗阻性黃疸后，大鼠腸黏膜巨噬細(xì)胞及細(xì)胞因子TNF-α的變化，從而探討膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于膽汁外引流術(shù)的作用機(jī)制，為梗阻性黃疸患者的臨床治療提供更多理論依據(jù)。

腸道巨噬細(xì)胞大多數(shù)位于腸黏膜固有層，起著抗原呈遞的作用，又具有吞噬細(xì)菌的功能，在腸道免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)活化的巨噬細(xì)胞可分泌許多細(xì)胞因子，主要是腫瘤壞死因子α(TNF-α)，從而激活免疫系統(tǒng)。TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有防御和致?lián)p傷的雙重作用，可作用于細(xì)胞膜受體(TNFR P55和P75)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、蛋白激酶激活和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、炎癥發(fā)生和纖維組織增生[5]，可誘導(dǎo)IL-1增加，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，適量分泌具有防御功能，過度則可損傷腸道黏膜，因而巨噬細(xì)胞過度激活、活化時(shí)造成細(xì)胞因子分泌紊亂，反而會(huì)造成腸道黏膜損傷。

在本實(shí)驗(yàn)中，梗阻性黃疸及膽汁內(nèi)外引流術(shù)解除黃疸的模型均由改良的大鼠手術(shù)成功建立[6]，四組大鼠腸黏膜巨噬細(xì)胞及TNF-α含量的變化均由免疫組化染色的方法定量測(cè)定，采用平均光密度值表示巨噬細(xì)胞及TNF-α表達(dá)的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞主要分布在固有層，TNF-α主要分布在炎癥細(xì)胞的胞漿。巨噬細(xì)胞及腫瘤壞死因子TNF-α在假手術(shù)對(duì)照組少量表達(dá)，梗阻性黃疸形成后，兩者表達(dá)均明顯增強(qiáng)，平均光密度值也明顯增高，這與其他一些動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這些實(shí)驗(yàn)表明：梗阻性黃疸時(shí)，盡管細(xì)胞免疫功能受損，但血清TNF-α炎癥細(xì)胞因子顯著升高[7-10]。梗阻性黃疸由膽汁內(nèi)引流術(shù)解除，大鼠腸黏膜巨噬細(xì)胞及TNF-α表達(dá)降低，平均光密度值下降，與梗阻性黃疸組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但梗阻性黃疸由膽汁外引流術(shù)解除，大鼠巨噬細(xì)胞及TNF-α表達(dá)數(shù)量仍較高，與梗阻性黃疸組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，從而進(jìn)一步證明了膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于外引流術(shù)，此結(jié)果與我們以前實(shí)驗(yàn)解除膽道梗阻可降低血液TNF-α水平，并且內(nèi)引流優(yōu)于外引流這一結(jié)論相似[11]。梗阻性黃疸時(shí)，腸黏膜免疫屏障受損，巨噬細(xì)胞細(xì)胞免疫紊亂，細(xì)胞因子TNF-α過度分泌，TNF-α可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡和非凋亡細(xì)胞的緊密連接使蛋白分解和功能改變，從而導(dǎo)致腸上皮通透性增加，同時(shí)可下調(diào)跨膜緊密連接前衛(wèi)蛋白的咬合啟動(dòng)子的表達(dá)，導(dǎo)致腸電生理功能發(fā)生紊亂[12]，最終使腸道黏膜清除細(xì)菌與內(nèi)毒素能力下降，發(fā)生細(xì)菌移位和內(nèi)毒素入學(xué)，能加劇梗阻性黃疸術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。

膽汁內(nèi)外引流術(shù)對(duì)梗阻性黃疸大鼠腸黏膜巨噬細(xì)胞和腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)抑制程度不同的準(zhǔn)確機(jī)制尚不清楚。膽汁有助于食物的消化和營養(yǎng)的吸收，與此同時(shí)膽汁內(nèi)的膽鹽可以控制大鼠腸內(nèi)細(xì)菌的繁殖，可以降低腸道內(nèi)毒素的產(chǎn)生，可以抑制細(xì)胞因子的過度分泌，可以有效減少過度的炎癥反應(yīng)[13]。大鼠的腸肝循環(huán)可通過膽汁內(nèi)引流術(shù)恢復(fù)，但是膽汁外引流術(shù)膽汁由大鼠頸背部流向體外，同時(shí)因?yàn)轶w外放置外引流管增加了細(xì)菌感染的概率。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明梗阻性黃疸時(shí)腸黏膜巨噬細(xì)胞及TNF-α表達(dá)增多，腸黏膜受損，膽汁內(nèi)引流術(shù)可以顯著改善這一狀況，而外引流術(shù)卻不能有效降低巨噬細(xì)胞及炎癥因子的分泌，進(jìn)一步支持膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于膽汁外引流術(shù)，為梗阻性黃疸患者的臨床治療提供理論依據(jù)。

[1]Tomazic A,Pleskovic A.Surgical outcome after pancreatouodenectomy:effect of preoperative biliary rainage[J].Hepatogastroenterology,2006,53(72):944-946.

[2]Ungerstedt JS,Grenader A,Bredbacka S,et al.Clotting onset time may be a predictor of outcome in human brain injury:a pilot study [J].J NeurosurgAnesthesiol,2003,15(1):13-18.

[3]劉海.阻塞性黃疸肝臟損傷機(jī)理研究新進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志,1996,12:125-127.

[4]Hu XG,Li ZH.Effects of recombinant human growth hormone on secretory immunoglobulin A of intestinal mucosa in rats with obstructive jaundice[J].Journal of Medical Science Yanbian University,2010,33(3):176-180.

[5]Aggarwal BB,Shihodia S,Ashikawa K,et al.The role of TNF and its family members in inflammatory and cancer:Lesson from gene deletion[J].Curr Drug Targets InflammAllergy,2002,1(4):327.

[6]Li W,Chung SC.An improved rat model of obstructive jaundice and its reversal by internal and external drainage[J].J Surg Res, 2001,101(1):4-15.

[7]Yorganci K,Baykal A,Kologlu M,et al.Endotoxin challenge causes a proinflammatory state in obstructive jaundice[J].J Invest Surg, 2004,17(3):119-126.

[8]Kerek M,Akyurek N,Sozuer EM,et al.Effects of recombinant platelet activating factor acetylhydrolase in obstrctive jaundice[J]. Hepatogastroenterology,2003,50(52):1097-1100.

[9]Hideaki Mi,Youinori M,Michttaka O,et al.Obstractive jaundice increases sensitivity to lipopolysaccharide via TLR4 upregulation: possible involvement in gut-derived hepatocyte growth factor-protection of hepatocytes[J].J Gastroenterol Hepatol,2005,20(12): 1859-1866.

[10]Kimmings AN,van Deventer SJ,Obertop H,et a1.Endotoxin,cytokines,and endotoxin binding proteinsin obstructive jaundice and after preoperative biliary drainage[J].Gut,2000,46(5):725-731.

[11]Meng Y,Cong YC,Dou Y,et al.Changes of serum cytokines and expression of inducible nitric oxide synthase mRNA by Kupffer cells after relief from obstructive jaundice in rats[J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24(6):1064-1069.

[12]Mankertz J,Tavalali S,Schmitz H,et a1.Expression from the human occluding promoter is affected by tumor necrosis factor alpha and interferon gamma[J].Cell Sci,2000,113(Pt 11):2085.

[13]Sane T,Ajiki T,Takeyama Y,et a1.Internal biliary drainage improves decreased number of gut mueosal T lymphocytes and MADCAMI expression in jaundiced rats[J].Surgery,2004,136(3): 693-699.

Effect of internal and external biliary drainages on macrophages and tumor necrosis factor-α levels of intestinal mucosa in rats with obstructive jaundice.

ZHAO Yan,LI Wen.Department of Gastroenterology and Hepatology,the Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of internal and external biliary drainages on macrophages and tumor necrosis factor-α(TNF-α)levels of intestinal mucosa in rats with obstructive jaundice.MethodsSixty adult healthy male SD rats with the weight of 300～350 g were randomly divided into four groups:obstructive jaundice group (OJ),external drainage group(ED),internal biliary drainage group(ID)and sham operation group(SH).The ileum tissues were taken on the 7th day after the second surgery.Immunohistochemistry was used to determine the expression change of CD68and TNF-α.ResultsFour groups of rats model were successfully established.Compared with SH group,the levels of CD68and TNF-α in rat intestinal mucosa of OJ group were significantly increased,and the mean optical density was increased[(0.58±0.050)vs(0.28±0.037),P＜0.01;(0.34±0.040)vs(0.14±0.021),P＜0.01].Compared with OJ group,the levels of CD68of the ID group significantly decreased and the mean optical density was significantly decreased[(0.49±0.049),P＜0.05)].Compared with the OJ group,the level of CD68of the ED group,was slightly decreased and the mean optical density was slightly decreased,with no statistically significant difference[(0.55±0.076), P＞0.05].The level of TNF-α in both ID and ED groups was reduced.The mean optical density was decreased[(0.29± 0.034),(0.33±0.030)].There was significant difference between ID group and OJ group(P＜0.01).but there was no significant difference between OJ and ED group(P＞0.05).ConclusionAfter common bile duct ligation,the level of macrophages and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in intestinal mucosa are significantly elevated in obstructive jaundice. The level of inflammatory cytokines could be reduced significantly by internal biliary drainage in intestinal mucosa of rats with obstructive jaundice,while external biliary drainage had less effect.Internal biliary drainage could be more efficient than external biliary drainage in the relief of intestinal mucosa injury induced by obstructive jaundice.

Obstructive jaundice;Internal biliary drainage;External drainage;Intestinal mucosa;Macrophages;Tumor necrosis factor-α

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0529

R-322

A

1003—6350(2013)09—1249—04

2013-03-01)

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30971355）

李聞。E-mail：liwen2000@yahoo.com