肖 宇，賈偉偉，李 雪，盧長(zhǎng)柱，王月飛，霍 紅，徐滿英

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室、2.機(jī)能學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006;3.黑龍江省醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150036;4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱 150081)

乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)廣泛的分布于哺乳動(dòng)物的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，作為一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與學(xué)習(xí)、記憶、睡眠、覺醒、體溫等生理功能的調(diào)節(jié)［1］。近幾年研究表明，ACh在傷害性信息的感覺和調(diào)控中起關(guān)鍵作用。在多種病理性疼痛的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)某些部位(如邊緣系統(tǒng))M受體明顯上調(diào)，這表明疼痛刺激可激活中樞的膽堿能系統(tǒng)。全身及椎管內(nèi)應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑或不同亞型的膽堿能M受體激動(dòng)劑可以提高痛閾，產(chǎn)生不同程度的鎮(zhèn)痛作用［2］。

海馬結(jié)構(gòu)的發(fā)育成熟是學(xué)習(xí)記憶、痛反應(yīng)、逃避行為等的基礎(chǔ)，新生鼠的海馬損傷能夠改變傷害性信息的處理機(jī)制［3］。海馬的皮質(zhì)分為 CA1、CA2、CA3和CA4四個(gè)區(qū)，其中CA1區(qū)被大量的研究證實(shí)與痛覺調(diào)制密切相關(guān)。向海馬CA1區(qū)內(nèi)注射微量的NMDA受體拮抗劑MK-801、AP-5或5-羥色胺受體拮抗劑利坦色林可以減輕動(dòng)物疼痛反應(yīng)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈鎮(zhèn)痛效應(yīng)，說明NMDA受體和5-TH受體系統(tǒng)參與了海馬鎮(zhèn)痛作用［4］。但海馬內(nèi)的膽堿能系統(tǒng)與疼痛的關(guān)系不是十分清楚［5］。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞外記錄神經(jīng)元放電的方法，觀察側(cè)腦室微量注射ACh及其M受體拮抗劑阿托品、受體激動(dòng)劑毛果蕓香堿對(duì)傷害性刺激引起的海馬CA1區(qū)中痛興奮神經(jīng)元(pain-excitation neurons，PEN)和痛抑制神經(jīng)元(pain-inhibition neurons，PIN)痛誘發(fā)電活動(dòng)的影響，進(jìn)而分析海馬CA1區(qū)中ACh及其M受體在痛覺信息調(diào)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用成年、健康 Wistar大鼠，清潔級(jí)，♂♀不拘，體質(zhì)量為200～280 g(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物中心提供，級(jí)別:Ⅱ，許可證號(hào):黑20020002)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將70只大鼠隨機(jī)分為4組:生理鹽水組10只，ACh組20只，ACh+阿托品組20只，毛果蕓香堿組20只。大鼠用氨基甲酸乙酯(200 g·L-1，5 ml·kg-1)腹腔注射麻醉，實(shí)施常規(guī)手術(shù)即氣管插管、顱骨開窗、分離坐骨神經(jīng)及按Pellegrino圖譜B坐標(biāo)系統(tǒng)［6］，將外徑0.8 mm 的“H”型不銹鋼腦室套管插入側(cè)腦室內(nèi)(A:0.2 mm;L、R:1.5 mm;H:3.0 mm)供注藥用。將大鼠的頭固定在SN-2立體定位儀上。將內(nèi)充3 mol·L-1氯化鉀溶液、尖端直徑0.5 ～1.0 μm，直流電阻為10 ～30 MΩ的玻璃微電極固定在SM-21型微電極操縱器上。用呼吸機(jī)維持呼吸，腹腔注射1 g·L-1氯化筒箭毒堿(1 ml·kg-1)用以制動(dòng)，松弛肌肉，排除肌細(xì)胞電活動(dòng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響。按Pellegrino圖譜B座標(biāo)系統(tǒng)，將微電極插入CA1區(qū)(A:-3.2～-4.0 mm;L/R:2.5～3.0 mm;H:2.5～3.1 mm)內(nèi)，由微電極引導(dǎo)神經(jīng)元放電，經(jīng)前級(jí)放大器放大，顯示于示波器上，并以(強(qiáng)度:5 mA，波寬:0.3 ms，間隔:5 ms，脈沖:5個(gè))的串脈沖刺激坐骨神經(jīng)作為傷害性刺激，引導(dǎo)痛反應(yīng)神經(jīng)元的放電。然后用ZCZ-50型自動(dòng)抽注儀向側(cè)腦室勻速注入ACh(20 g·L-1，10 μl)，阿托品(5 g·L-1，10 μl)或毛果蕓香堿(20 g·L-1，10 μl)，所有藥品均在 2 min內(nèi)注完。觀察注藥前、后 PEN和 PIN電活動(dòng)的變化，并用 STCH707X型雙道磁帶記錄器記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)處理儀Powerlab/8 s(ADInstruments)和Chart v5.3軟件分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)差異用重復(fù)測(cè)量方差分析和F檢驗(yàn)。組間差異的顯著性用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 側(cè)腦室微量注射ACh對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)中PEN電活動(dòng)的影響 ACh組，記錄到25個(gè)PEN。注入ACh后2 min PEN誘發(fā)放電凈增值開始減少，放電潛伏期延長(zhǎng)(Fig 1b)。在注藥后4 min作用達(dá)到高峰，凈增值由注藥前(9.18±2.03)Hz減少至(2.95±1.03)Hz;PEN誘發(fā)放電潛伏期由注藥前的(140±16.9)ms延長(zhǎng)至(580±47.7)ms。注藥后2～12 min，PEN 的凈增值(F=3.675，P ＜0.05)和潛伏期(F=4.985，P＜0.01)與生理鹽水組同期數(shù)據(jù)相比差異有顯著性(Fig 2)。注藥后14 min PEN的凈增值和潛伏期開始逐漸恢復(fù)。生理鹽水組在注入生理鹽水前、后PEN的放電活動(dòng)無明顯變化(Fig 1a，F(xiàn)ig 2)。

ACh+阿托品組，記錄到23個(gè) PEN。注入ACh后2 min，PEN誘發(fā)放電凈增值減少，潛伏期延長(zhǎng)(Fig 1c)。注入阿托品即刻，ACh對(duì)PEN電活動(dòng)的抑制作用開始減弱。注入阿托品后2 min凈增值增加到(7.31±1.28)Hz，潛伏期縮短為(220±26.3)ms，PEN放電活動(dòng)基本恢復(fù)正常。注射阿托品后0 ～8 min，PEN的凈增值(F=2.378，P＜0.01)和潛伏期(F=4.257，P＜0.05)與 ACh組同期相比差異有顯著性(Fig 2)。

Fig 1 Effects of icv injection of saline(a)，ACh(b)，atropine(c)，pilocarpine(d)on the evoked discharge of PEN in the hippocampal CA1 area

毛果蕓香堿組，記錄到22個(gè)PEN。注入毛果蕓香堿后2 min PEN誘發(fā)放電頻率凈增值開始減小，潛伏期延長(zhǎng)，注藥后4 min作用最明顯(Fig 1d)。注毛果蕓香堿后 2～12 min，PEN的凈增值(F=3.149，P ＜0.05)和潛伏期(F=2.583，P ＜0.05)與生理鹽水組同期相比，差異有顯著性(Fig 2)。

Fig 2 Effects of icv injection of different drugs on the NIV(A)and latency(B)of PENs in the CA1 area

2.2 側(cè)腦室微量注射ACh對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)中PIN電活動(dòng)的影響 ACh組，記錄到20個(gè)PIN。注入ACh后2 min凈增值開始增加，而完全抑制時(shí)程開始縮短(Fig 3b)。注藥后4 min作用達(dá)到高峰，凈增值由注藥前的(-6.12±1.78)Hz增加至(-1.45±0.82)Hz，完全抑制時(shí)程由注藥前的(440±37.8)ms縮短至(130±19.5)ms。注ACh后2～12 min，PIN 的凈增值(F=5.184，P ＜0.01)和完全抑制時(shí)程(F=3.641，P＜0.01)，與生理鹽水組同期相比差異有顯著性(Fig 4)。注ACh后14 min，PIN誘發(fā)放電活動(dòng)開始逐漸恢復(fù)。生理鹽水組，注入生理鹽水前、后PIN的電活動(dòng)沒有明顯變化(Fig 3a，F(xiàn)ig 4)。

Fig 3 Effects of icv injection of saline(a)，ACh(b)，atropine(c)，pilocarpine(d)on the evoked discharge of PIN in the hippocampal CA1 area

在ACh+阿托品組，記錄到17個(gè)PIN。注入ACh后2 min，PIN誘發(fā)放電的凈增值增加，完全抑制時(shí)程縮短。注入阿托品即刻，ACh對(duì)PIN電活動(dòng)的作用開始減弱。注阿托品后2 min凈增值減少到(-4.95±1.05)Hz，完全抑制時(shí)程延長(zhǎng)到(350±29)ms，PIN放電活動(dòng)明顯恢復(fù)。注入阿托品后0～8 min，ACh+阿托品組PIN的凈增值(F=3.963，P＜0.01)和完全抑制時(shí)程(F=1.869，P＜0.05)與ACh組同期相比差異有顯著性(Fig 4)。

毛果蕓香堿組，記錄到19個(gè)PIN。注入毛果蕓香堿后2 min，PIN的凈增值開始增加，完全抑制時(shí)程縮短，注藥后4 min作用最明顯(Fig 3d)。注入毛果蕓香堿后2～12 min，PIN的凈增值(F=2.569，P＜0.01)和完全抑制時(shí)程(F=5.762，P＜0.05)與生理鹽水組同期相比差異有顯著性(Fig 4)。

Fig 4 Effects of icv injection of different drugs on the NIV(A)and inhibition duration(B)of PINs in the CA1 area

3 討論

海馬結(jié)構(gòu)參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多重要功能的調(diào)節(jié)，并被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的中樞。近年來，海馬在痛覺感受和痛相關(guān)行為表現(xiàn)中的作用也得到廣泛的研究和認(rèn)可。認(rèn)為海馬可以接受痛覺傳入，是伴有情緒活動(dòng)的痛反應(yīng)的較高級(jí)中樞。應(yīng)用活體微量滲析技術(shù)和高效液相色譜分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)疼痛可以激活海馬內(nèi)膽堿能神經(jīng)元，導(dǎo)致CA1區(qū)錐體細(xì)胞ACh釋放增加。文獻(xiàn)報(bào)道激活膽堿能神經(jīng)元的活動(dòng)在多種動(dòng)物(包括人類)中樞起抗傷害和鎮(zhèn)痛作用［5，7］。Harte等發(fā)現(xiàn)的證據(jù)支持髓板內(nèi)丘腦的 M受體參與了抗傷害性反應(yīng)。藥理實(shí)驗(yàn)表明向腦內(nèi)的特定核團(tuán)注射卡巴膽堿也起抗傷害性作用，并且這種作用可被M受體拮抗劑所逆轉(zhuǎn)［8］。同時(shí)一些其它受體或藥物的鎮(zhèn)痛作用也可通過ACh來調(diào)節(jié)。Sumatriptan(5-HT受體激動(dòng)劑)可通過加強(qiáng)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生抗傷害性的作用［9］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，側(cè)腦室注入ACh使CA1區(qū)PEN誘發(fā)放電頻率減少，潛伏期延長(zhǎng)，抑制了PEN的痛誘發(fā)放電活動(dòng);使PIN痛誘發(fā)放電頻率增多，完全抑制時(shí)程縮短，而增強(qiáng)了PIN的電活動(dòng)。這些結(jié)果證明，外源性ACh可使大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)PEN對(duì)傷害性刺激的反應(yīng)降低，同時(shí)PIN的電活動(dòng)增強(qiáng)表現(xiàn)為鎮(zhèn)痛效應(yīng)。這與ACh在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗傷害性作用的觀念是一致的。

海馬結(jié)構(gòu)中含有豐富的膽堿能纖維和膽堿能敏感細(xì)胞及受體，ACh在海馬中作為一種重要的活性物質(zhì)，參與海馬生理功能的調(diào)節(jié)。中縫大核、束旁核、紅核、韁核等部位注射膽堿能受體激動(dòng)劑，可提高貓和大鼠的痛閾，并抑制內(nèi)臟和軀體傷害性信息的傳遞［10-11］。在本實(shí)驗(yàn)中，側(cè)腦室注入M受體激動(dòng)劑毛果蕓香堿產(chǎn)生與ACh相似的作用，抑制CA1區(qū)PEN的痛誘發(fā)放電活動(dòng)，增強(qiáng)PIN痛誘發(fā)放電活動(dòng)。而注入M受體抑制劑阿托品后，PEN的電活動(dòng)迅速恢復(fù)到正常水平，說明阿托品可以翻轉(zhuǎn)ACh的鎮(zhèn)痛作用。提示，ACh的作用是通過M受體實(shí)現(xiàn)的。膽堿能受體的激動(dòng)劑和拮抗劑在海馬CA1區(qū)痛覺調(diào)制中的作用可能類似于ACh在脊髓水平的鎮(zhèn)痛作用。Abelson等［12］揭示了脊髓ACh釋放與痛閾的關(guān)系，ACh增加約30%可產(chǎn)生抗傷害性作用，若ACh減少30%則可產(chǎn)生痛覺過敏［12］。所以，給予外源性的ACh產(chǎn)生抗傷害性效應(yīng)。此外，毛果蕓香堿激活內(nèi)源性的ACh產(chǎn)生相似的抗傷害性效應(yīng)。而阿托品阻斷了內(nèi)源性的ACh產(chǎn)生致痛作用。也就是說在海馬CA1區(qū)無論是內(nèi)源性還是外源性的ACh都產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

海馬與隔核、尾核、中縫大核、前腦、紋狀體等與痛覺的調(diào)制密切相關(guān)的核團(tuán)有著廣泛的纖維聯(lián)系，而在這些部位均含有豐富的膽堿能纖維和膽堿能神經(jīng)元分布。已有研究證實(shí)，隔核和前腦的膽堿能纖維投射至CA1區(qū)能夠影響CA1區(qū)突觸可塑性和CA1區(qū)錐體細(xì)胞的電活動(dòng)［13］。所以，ACh也可能是作用于其它核團(tuán)內(nèi)的神經(jīng)元，再間接地影響CA1區(qū)神經(jīng)元活動(dòng)。腦室注射比核團(tuán)內(nèi)注射牽涉范圍廣、影響因素多，可能影響到中樞的多個(gè)部位。為了減少這些因素的影響以及證明上述理論，在今后的實(shí)驗(yàn)中可以采用核團(tuán)內(nèi)注射藥物的方法，觀察其對(duì)大鼠CA1區(qū)痛反應(yīng)神經(jīng)元電活動(dòng)的影響。因此，ACh對(duì)CA1區(qū)的作用路徑及機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究。

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