左 亮，原冬冬，張 媛，王 琴，陶 亮

(中山大學中山醫(yī)學院藥理學教研室，廣東廣州 510080)

阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)又稱為老年癡呆，是一種常見的神經退行性疾病，在80歲以上的老人中發(fā)病率高達40%［1－2］。其主要表現為漸進性記憶障礙、認知功能障礙等神經精神癥狀，嚴重影響患者的社交、職業(yè)與生活功能。AD典型的病理變化包括大腦組織中老年斑的形成，神經元纖維纏結并伴隨膽堿能神經元丟失［3］。AD發(fā)生時腦內的膽堿能神經元數量減少，導致乙酰膽堿含量的下降，該學說是目前較為公認的AD的發(fā)病機制之一［4］，也是AD治療獲得有限療效的重要基礎。迄今為止國內外批準用于AD治療的藥物不多，代表藥物為膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊，其機制主要是通過抑制腦中膽堿酯酶而抑制乙酰膽堿降解，增加局部乙酰膽堿濃度改善神經遞質的傳遞功能。但是多奈哌齊的療效維持時間短;隨著病程的進展，當功能完整的膽堿能神經元漸趨減少時，多奈哌齊的作用也逐漸減弱。此外，多奈哌齊在臨床上已使用多年，長期使用會產生耐藥性;因此，開發(fā)新的能有效治療AD的藥物十分重要。AD-08是我們對多奈哌齊的化學結構進行基團改造、合成的具有自主知識產權的新型化合物。前期的實驗證明，AD-08具有脂溶性好，可有效透過血腦屏障，在腦內濃度為血漿中的8倍;并且在體外抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的效價是抑制丁酰膽堿酯酶效價的50倍以上。因此，我們認為該化合物具有較好的開發(fā)前景，并有可能成為治療AD的新型藥物。本研究在動物癡呆模型上，初步研究了AD-08對癡呆動物學習記憶能力的改善作用，以及對大腦海馬組織AChE活性的影響，為AD-08的進一步開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Aβ1-42(貨號A9810)購自Sigma公司;多奈哌齊和AD-08均由國內某知名藥企提供;乙酰膽堿酯酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Morris水迷宮測試系統(tǒng)購自淮北正華生物儀器設備有限公司;大鼠腦立體定位儀(NARISHIGE SN-3型)購自日本成茂公司;酶標儀購自美國biotek公司;微量進樣器(規(guī)格5 μl)購自上海高鴿工貿有限公司。

1.2 動物與分組 健康成年♂ SD大鼠48只，質量(200±20)克，SPF級，批號 SCXK(粵)2008-0002，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，APP/PS1雙轉基因小鼠40只，具有相同遺傳背景的正常對照小鼠8只，♂(3月齡)，由南京大學國家遺傳工程小鼠資源庫提供，許可證號SCXK(蘇)2010-0001。兩種動物均隨機分為分成正常組、模型組、陽性藥(多奈哌齊)對照組、AD-08低、中、高劑量組，每組8只。正常組SD大鼠于側腦室注射生理鹽水5 μl;陽性藥對照組和AD-08各劑量組于側腦室注射Aβ1-42蛋白5 μl(10 μg)。大鼠術后灌胃給藥，多奈哌齊和AD-08均用生理鹽水溶解。給藥劑量分別為:多奈哌齊3 mg·kg－1、AD-08 低劑量組0.7 mg·kg－1、中劑量組 3.5 mg·kg－1、高劑量組 7 mg·kg－1，給藥容量為每100 g體質量1 ml;每日1次，共給藥8 d。APP/PS1雙轉基因小鼠養(yǎng)至6月齡，正常對照組及模型組灌胃給予相應劑量的藥物溶劑(生理鹽水);多奈哌齊組和AD-08各組分別按體重給與相應劑量的藥物:多奈哌齊1 mg· kg－1、AD-08低劑量組1 mg·kg－1、中劑量組 5 mg·kg－1、高劑量組 10 mg·kg－1，每天1次，共給藥1個月。

1.3 Aβ1-42的配制［5］0.1 mg Aβ1-42溶于 50 μl生理鹽水，稀釋為 2 mg·L－1，37℃恒溫箱孵育 5 d，－20℃冰箱保存，切忌反復凍融。

1.4 癡呆動物模型的建立［6］大鼠腹腔注射400 mg·kg－1的水合氯醛麻醉。將麻醉的大鼠固定于大鼠腦立體定位儀上，定位參照George Paxinos和Charles Watson合著的第5版大鼠腦立體定位圖譜，定位方法:前囟向后1.08 mm，中線旁開2.5 mm，硬腦膜下3.7 mm。用微量進樣器注射，每只大鼠注射5 μl Aβ1-42(2 mg·L－1)，緩慢注射，注完留針10 min以保證其充分彌散，緩慢撤針，縫合消毒。

1.5 Morris水迷宮實驗 實驗方法參照文獻［7－8］，并作適當地修改。實驗時間總共 5 d，以定位航行、空間探索為指標。定位航行實驗連續(xù)進行4 d，觀察和記錄實驗動物尋找并爬上平臺所需時間，即潛伏期。最后1 d(d 5)進行空間探索實驗，記錄動物第1次到達原平臺位置的時間、穿越原平臺的次數以及在目標象限活動的時間百分比。

1.6 AChE活性測定 Morris水迷宮測試結束后，將動物斷頭、取出大腦;迅速分離海馬，按所取海馬的重量，加9倍重量的生理鹽水制備腦組織勻漿，3 500 r·min－1離心10 min;取上清液置于 －20℃冰箱保存。根據南京建成生物工程研究所提供的乙酰膽堿酯酶活性測試盒的說明書測定乙酰膽堿酯酶活性;用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。

1.7 數據的分析與統(tǒng)計 采用Sigma Plot 10.0統(tǒng)計軟件對結果進行分析，所有數值均采用±s表示，分析方法采用Student's t-test。

2 結果

2.1 定位航行實驗 定位航行實驗結果見Tab 1、2。結果表明，各組實驗動物找到平臺的時間(即潛伏期)，隨著訓練進程而逐漸縮短。模型組從訓練d 3開始，動物的潛伏期延長，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而給予AD-08和多奈哌齊后，SD大鼠和APP/PS1雙轉基因小鼠的潛伏期均明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

Tab 1Effects of AD-08 on escape latency in rats(±s，n=8)

Tab 1Effects of AD-08 on escape latency in rats(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Control 76.23 ±5.35 54.64 ±6.12 33.16 ±5.46* 24.77 ±3.35*AD 80.33 ±5.59 65.13 ±5.45 64.81 ±5.02 60.28 ±4.25 Donepezil 79.91 ±5.46 52.47 ±5.85 35.49 ±4.45* 21.49 ±4.68*AD-08 0.7 mg·kg－1 74.27 ±5.91 65.92 ±5.28 36.28 ±4.75* 28.67 ±5.19*AD-08 3.5 mg·kg－1 74.11 ±5.81 58.09 ±4.52 31.00 ±4.83* 22.15 ±5.03*AD-08 7 mg·kg－1 80.04 ±5.28 64.31 ±5.21 36.85 ±5.21* 24.29 ±5.12*

Tab 2 Effects of AD-08 on escape latency in APP/PS1 mice(±s，n=8)

Tab 2 Effects of AD-08 on escape latency in APP/PS1 mice(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Control 53.16 ±5.19 34.23 ±4.15* 32.20 ±4.06* 29.21 ±3.61*AD 67.30 ±7.02 58.21 ±6.58 52.54 ±7.06 51.63 ±6.01 Donepezil 61.12 ±6.12 42.44 ±5.35 39.20 ±6.28* 29.43 ±6.16*AD-08 1 mg·kg－1 60.56 ±5.94 41.82±6.87 31.80±5.29* 24.84±4.30*AD-08 5 mg·kg－1 47.60 ±6.47 53.39±7.46 48.49±8.33 26.12±7.55*AD-08 10 mg·kg－1 54.49 ±6.50 36.34 ±5.31* 30.70 ±4.67* 28.70 ±5.12*

2.2 空間搜索實驗 空間探索實驗結果見Tab 3、4。結果顯示:模型組動物穿越平臺位置的次數，以及在目標象限活動時間的百分比明顯少于正常組(P＜0.05);而給予AD-08多奈哌齊后，SD大鼠和APP/PS1雙轉基因小鼠穿越平臺位置的次數增多，在目標象限活動時間的百分比升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。定位航行實驗和空間探索實驗的結果表明，AD-08能夠明顯的改善癡呆動物的空間學習記憶能力。

2.3 AChE活性測定 Tab 5、6的結果顯示，側腦室注射Aβ1-42蛋白的癡呆模型大鼠和APP/PS1雙轉基因小鼠海馬組織中的AChE活性與正常對照組相比明顯升高(P＜0.05);給予AD-08和多奈哌齊后，上述模型動物海馬組織的AChE活性明顯低于模型組(P＜0.05)。

Tab 3 Results of spatial probe test on rats treated by Aβ1-42(±s，n=8)

Tab 3 Results of spatial probe test on rats treated by Aβ1-42(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group Crossings of the former platform Percentage of swimming tim in target quadrant/%Control 3.75 ±0.75* 27.80 ±1.87 e*AD 0.88 ±0.30 19.78 ±1.61 Donepezil 3.13 ±0.61* 25.83 ±1.98*AD-08 1 mg·kg－1 3.00 ±0.33* 26.94 ±2.11*AD-08 5 mg·kg－1 3.88 ±0.35* 25.72 ±1.29*AD-08 10 mg·kg－1 3.13 ±0.44* 26.61 ±1.64*

Tab 4Results of spatial probe test on APP/PS1 mice(±s，n=8)

Tab 4Results of spatial probe test on APP/PS1 mice(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group Crossings of the former platform Percentage of swimming tim in target quadrant/%Control 3.56 ±0.65* 28.25 ±3.54 e*AD 1.09 ±0.25 18.86 ±1.84 Donepezil 3.64 ±0.62* 29.07 ±1.22*AD-08 1 mg·kg－1 2.83 ±0.42* 26.26 ±1.44*AD-08 5 mg·kg－1 3.50 ±0.67* 30.76 ±3.33*AD-08 10 mg·kg－1 3.08 ±0.55* 27.69 ±5.30*

Tab 5 Effect of AD-08 on acetylcholinesterase activity in rats(±s，n=8)

Tab 5 Effect of AD-08 on acetylcholinesterase activity in rats(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group AChE activity Control 0.33 ±0.04*AD 0.66 ±0.07 Donepezil 0.34 ±0.04*AD-08 0.7 mg·kg－1 0.32 ±0.06*AD-08 3.5 mg·kg－1 0.30 ±0.02*AD-08 7 mg·kg－1 0.31 ±0.05*

Tab 6 Effects of AD-08 on acetylcholinesterase activity in APP/PS1 mice(±s，n=8)

Tab 6 Effects of AD-08 on acetylcholinesterase activity in APP/PS1 mice(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group AChE activity Control 0.23 ±0.02*AD 0.54 ±0.05 Donepezil 0.31 ±0.05*AD-08 1 mg·kg－1 0.27 ±0.03*AD-08 5 mg·kg－1 0.31 ±0.05*AD-08 10 mg·kg－1 0.31 ±0.03*

3 討論

由于AD的發(fā)病機制至今尚未被闡明，目前還沒有能夠通過制止神經元退行性病變來治療AD的藥物;現在臨床上應用的抗AD藥物主要有膽堿酯酶抑制劑(如多奈哌齊、石杉堿甲、利斯的明)、谷氨酸受體拮抗劑(如美金剛)以及改善腦循環(huán)和腦代謝的藥物(如尼莫地平、腦復新等)。本研究在不同癡呆動物模型上評價了新型化合物AD-08對癡呆動物學習記憶的影響。我們的研究結果表明，AD-08能夠明顯改善癡呆模型動物的學習記憶能力，其作用與多奈哌齊相似;同時發(fā)現，AD-08的作用機制可能與抑制乙酰膽堿酯酶的活性有關。

AD典型的病理變化包括老年斑的形成，神經元纖維纏結并伴隨膽堿能神經元的丟失［9］。Aβ淀粉樣蛋白是老年斑的主要成分之一。沉積的Aβ蛋白對神經元有毒性作用，可損害膽堿能神經元而導致學習記憶能力下降。我們采用的側腦室注射Aβ蛋白的方法是目前臨床前藥效學評價的經典模型［10］。APP/PS1雙轉基因小鼠是在APP蛋白的第670位和671位的氨基酸發(fā)生雙突變以及PS1基因的第9個外顯子敲除后得到的AD模型;通過基因突變和敲除，導致Aβ產生增多，能夠模擬AD患者的大部分的病理特征，是一種評價AD治療藥物療效的可靠模型［11］。研究表明［12］，Aβ 蛋白沉積可造成膽堿乙酰轉移酶活性降低，引起Aβ沉積周圍的膽堿能神經元減少，進而導致記憶損傷。Aβ也可作用于膽堿能神經元末梢，通過抑制膽堿的攝取而減少乙酰膽堿合成，從而使大腦海馬和皮質釋放的乙酰膽堿減少。此外，Aβ可降低丙酮酸脫氫酶的活性，減少葡萄糖和糖原攝取，加速膽堿能神經元變性。葡萄糖代謝降低還使乙酰輔酶A生成減少，使乙酰膽堿合成受阻，進而導致膽堿能神經元和海馬神經元功能減退甚至死亡。因此，能夠增強大腦膽堿能神經功能的藥物可以改善Aβ沉積引起的學習記憶障礙［13］。

AD-08是經過篩選得到的一種具有較好開發(fā)價值的新型化合物;它是根據多奈哌齊的化學結構改造合成的。在篩選過程中發(fā)現，該化合物脂溶性好，生物利用度高，并且能有效透過血腦屏障，在體外對乙酰膽堿酯酶具較高的選擇性。其不良反應少，長期使用對肝臟影響小，這些優(yōu)點使其有可能成為治療AD的新型藥物，具有重要的研究價值。本研究發(fā)現，在兩種癡呆動物模型，3個實驗劑量的AD-08均能改善癡呆動物的學習記憶功能，并能明顯降低模型組腦組織中AChE的活性;AD-08的上述作用與相同劑量的多奈哌齊相似。本研究的結果提示，AD-08對Aβ蛋白沉積引起的癡呆動物學習記憶功能的改善作用可能是通過抑制大腦AChE活性，增強膽堿神經元功能產生的。

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