黃端華，張銀平，劉 薇，張 蘭

(1.福建船政交通職業(yè)學(xué)院安全技術(shù)與環(huán)境工程系，福建福州 350007;2.福州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院食品安全分析與檢測(cè)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002)

0 引言

胡蘆巴是豆科一年生草本植物，藥用部位是成熟后的胡蘆巴干種子，有祛風(fēng)、溫腎、祛寒、抗糖尿病、降低膽固醇等功效，該藥材能治療腹脅脹滿、支氣管炎、寒疝、腎臟冷虛.中藥胡蘆巴中富含生物堿、黃酮和皂苷等成分，其中胡蘆巴堿(TR)、槲皮素(QU)和柚皮素(NA)等為主要有效成分［1］.圖1為T(mén)R、QU和NA的分子結(jié)構(gòu)圖.葫蘆巴堿具有止咳、退熱、降血糖、降膽固醇等作用［2］;柚皮素能治療細(xì)菌感染，具有鎮(zhèn)靜、利膽等作用;槲皮素是較常見(jiàn)的黃酮類(lèi)物質(zhì)，具有平喘、降血壓和止咳等作用.我國(guó)胡蘆巴主要分布在四川、河南、安徽等地區(qū)，因產(chǎn)地或采摘季節(jié)不同，各產(chǎn)區(qū)胡蘆巴中主要成分的含量存在較大差異.人們對(duì)醫(yī)藥使用要求逐漸提高，中藥成分的含量、藥理及結(jié)構(gòu)分析日益受到重視，因此準(zhǔn)確快速測(cè)定胡蘆巴藥材中的有效成分含量對(duì)葫蘆巴質(zhì)量控制及確保臨床療效有重要的指導(dǎo)意義.

目前，已有報(bào)道采用高效液相色譜法單獨(dú)測(cè)定胡蘆巴種子中TR的含量［3－4］及研究TR在大鼠體內(nèi)的代謝分析［5］.HPLC作為一種常規(guī)的分析方法操作較繁瑣且易造成環(huán)境污染，而近年來(lái)，毛細(xì)管電泳法因其高效、快速、操作簡(jiǎn)便和分離模式多等優(yōu)點(diǎn)，已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道采用CE法測(cè)定天然藥物中的有效成分，Wang Hai－yan等［6］采用毛細(xì)管電泳場(chǎng)放大樣品堆積測(cè)定苦參中的生物堿，Yin Xiao－fang等［7］采用MSS－CE法分析中成藥中的的士寧和馬錢(qián)子堿，Gan Zhi－bin等［8］采用CE法分析槐米和秦皮中的生物活性成分.對(duì)葫蘆巴干種子中多種有效成分的提取并進(jìn)行質(zhì)量分析還未有文獻(xiàn)報(bào)道.本研究采用毛細(xì)管電泳法同時(shí)分離和檢測(cè)TR、QU和NA三種組分，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)采用普通區(qū)帶電泳法同時(shí)分離和檢測(cè)這3種物質(zhì)時(shí)只出現(xiàn)兩個(gè)峰，其中一個(gè)被有機(jī)溶劑的倒峰重疊，難以被檢出.本研究通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，選擇了合適的添加劑和最優(yōu)的電泳介質(zhì)，成功解決了該問(wèn)題，并實(shí)現(xiàn)葫蘆巴中TR、QU和NA在高效毛細(xì)管電泳儀中的同時(shí)分離和檢測(cè).

圖1 TR，QU和NA的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of TR，QU and NA

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效毛細(xì)管電泳儀(俄羅斯LUMEX公司，105型)，包括可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(190～400 nm);M1cw15工作站(俄羅斯LUMEX公司);未涂層熔融石英毛細(xì)管，70 cm×75 μm(id)，有效長(zhǎng)度60 cm，購(gòu)自河北永年縣銳豐色譜器件有限公司;紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)，雙光束(760CRT).

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胡蘆巴種子藥材購(gòu)自福州藥店，TR、NA和QU的標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所).硼酸、硼砂、磷酸二氫鉀(KDP)、DMF、甲醇和曲拉通X－100均為AR級(jí)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，水為二次蒸餾水.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)胡蘆巴藥材成分的提取及制備.準(zhǔn)確稱取2.990 g的胡蘆巴種子，加入5 mL水和0.07 569 g NaCl浸泡24 h.采用超聲波儀處理30 min后，過(guò)濾獲得透明液體，并準(zhǔn)確定容至5 mL.取300 μL樣品，添加100 μL 甲醇和 600 μL 水，用0.22 μm 的濾膜過(guò)濾.

2)對(duì)照品溶液的配制.精確稱取0.300 mg TR、QU和NA，加入體積比為2∶1的甲醇和水溶液，利用超聲處理使組分充分溶解，分別配制成濃度為1 000 μg·mL－1的溶液.

3)運(yùn)行液的配制.分別精確稱取3.814和1.362 g的硼砂和磷酸二氫鉀(KDP)，定容于100 mL的容量瓶，配制成濃度為0.1 mol·L－1硼砂(Na2B4O7·10H2O)和 0.1 mol·L－1的磷酸二氫鉀(KDP)母液.將稀釋成10 mmol·L－1的KH2PO4(KDP)溶液分別與10 mmol·L－1Na2B4O7的溶液根據(jù)配制表的比例進(jìn)行混合，配得pH為5.80～9.20的一系列KDP－Na2B4O7緩沖液.分析所用樣品及運(yùn)行緩沖液在使用前均經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾，并作超聲脫氣處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)TR、QU和NA 3組分的分子結(jié)構(gòu)，經(jīng)紫外分光光度計(jì)在190～400 nm范圍內(nèi)掃描，得知TR、QU和NA在200～240 nm范圍內(nèi)均有較好的紫外吸收，如圖2所示.再經(jīng)毛細(xì)管電泳分析試驗(yàn)3種混合成分在204～244 nm之間5個(gè)波長(zhǎng)下的出峰情況，選定檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm.

圖2 TR、QU、NA的吸收譜圖Fig.2 The wavelength spectrogram of TR，QU and NA

2.2 電泳介質(zhì)的選擇

分別以20 mmol·L－1pH 7.0磷酸鹽體系、20 mmol·L－1pH 9.0 硼酸鹽體系、10 mmol·L－1pH 3.0 檸檬酸體系及30 mmol·L－1pH 9.0 KDP － 硼砂緩沖體系為運(yùn)行緩沖液，考察了不同的緩沖體系對(duì)出峰情況和分離效果的影響.結(jié)果表明，在硼酸－硼砂、檸檬酸鹽和磷酸氫二鉀－磷酸二氫鉀緩沖介質(zhì)中柚皮素與槲皮素?zé)o法出峰或難以分離;只有在KDP－硼砂緩沖液中能觀察到其中的兩個(gè)組分，且兩組分電泳峰尖銳、峰形對(duì)稱，因此選擇KDP－硼砂溶液作為電泳介質(zhì).

2.3 運(yùn)行液KDP－硼砂濃度的選擇

試驗(yàn)了緩沖液濃度為3～15 mmol·L－1的6個(gè)點(diǎn)，反映緩沖溶液濃度對(duì)分析物分離效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可知，隨著濃度的增加，遷移時(shí)間也延長(zhǎng)，但分離度得到了提高，濃度為10 mmol·L－1的緩沖溶液能夠使樣品在較短的時(shí)間內(nèi)得到較好的分離，因此選擇濃度為10 mmol·L－1.

2.4 KDP－硼砂運(yùn)行液酸度的優(yōu)化

考察了pH值在7.2～9.0時(shí)，添加體積分?jǐn)?shù)為0.25%DMF、0.25%曲拉通的10 mmol·L－1KDP－硼砂緩沖液對(duì)TR、NA、QU分離效果的影響.緩沖溶液的pH值在電泳分離中起著重要作用，它將影響電滲流，影響分析物的遷移時(shí)間.圖4表明，隨著pH值的增大，3種組分呈現(xiàn)良好的分離趨勢(shì).pH為7.8時(shí)，3種組分遷移時(shí)間較短又能得到完全分離，選定pH為7.8.

圖3 KDP－硼砂體系濃度與分析時(shí)間曲線圖Fig.3 Effect of concentration on migration time

圖4 pH對(duì)分析時(shí)間的影響Fig.4 Effect of pH on migration time

2.5 電泳介質(zhì)中添加劑的選擇及優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)顯示，選擇合適的分離緩沖溶液體系可使3種組分達(dá)到一定的分離度，但溶劑的倒峰與葫蘆巴堿重合使其無(wú)法檢出.有文獻(xiàn)報(bào)道在緩沖液體系中適當(dāng)引入一定量的有機(jī)溶劑或表面活性劑等添加劑可有效地改善樣品的遷移時(shí)間和分離效果［9］，進(jìn)而提高分離選擇性.實(shí)驗(yàn)考察了有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、乙腈、DMF和表面活性劑SDS、triton X－100、吐溫80、CTMB對(duì)分離效果的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同時(shí)添加曲拉通和DMF對(duì)溶劑與TR的分離有明顯效果，能改善TR和溶劑的分離.通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察triton X－100與DMF體積濃度的大小對(duì)甲醇和葫蘆巴堿分離的影響.

2.5.1 Triton X －100 濃度的選擇

在KDP－硼砂運(yùn)行液中，3種組分能得到較好的分離，但TR在沒(méi)有添加Triton X－100和DMF的情況下因受溶劑影響，TR峰與溶劑倒峰相重合.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得知，曲拉通的加入減小了溶劑的影響.在電泳介質(zhì)中添加表面活性劑曲拉通，能夠降低電滲流，使各組分的遷移時(shí)間產(chǎn)生差異.配制含曲通濃度為0.05%、0.10%、0.15%和0.25%的電泳緩沖液，得到TR與溶劑的分離電泳譜圖，見(jiàn)圖5.圖5表明，曲拉通加入量的增加使得TR受到的影響逐漸減小，TR的峰從未能檢出到峰高逐漸增大，甲醇的倒峰與TR的分離也逐漸明顯;圖5(d)中，TR的檢出不受溶劑影響，增加濃度后TR的峰高與圖5(d)大致相同，為縮短分析時(shí)間，選擇曲拉通體積分?jǐn)?shù)為圖5(d)所對(duì)應(yīng)的0.25%.文中添加的曲拉通濃度未達(dá)到臨界膠束濃度(cmc為0.18 mmol·L－1)，僅作為添加劑使用，Trition X－100是一種非電解質(zhì)高分子添加劑，它能增加緩沖液黏度，可能形成分子團(tuán)或特殊的局部結(jié)構(gòu)，抑制或消除電滲，從而影響樣品的遷移過(guò)程，改善分離［10］.

圖5 不同體積濃度triton X－100的影響Fig.5 The effect of triton concentration on resolution

2.5.2 DMF 濃度的影響

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，在電泳介質(zhì)中僅加入DMF或僅加入曲拉通，或者其他的添加劑，均無(wú)法實(shí)現(xiàn)TR與溶劑的分離，只有當(dāng)DMF與曲拉通進(jìn)行混合使用，兩種添加劑的共同作用才使溶劑的干擾減小.在電泳介質(zhì)中DMF與曲拉通的共同作用表現(xiàn)出高的粘度，TR是帶電的兩性物質(zhì)，溶劑為中性，兩者的遷移速率在添加劑作用下產(chǎn)生了差異.圖6是DMF濃度對(duì)分離的影響.結(jié)果顯示，圖6(c)體積分?jǐn)?shù)為0.25%的TR的檢出不受溶劑干擾，分離效果最好，遷移時(shí)間最短.

2.6 最佳分離條件

圖6 DMF濃度的選擇Fig.6 Effect of DMF concentration on resolution

選擇最佳分離條件為:緩沖溶液為濃度為10 mmol·L－1、pH 為7.8 的 KDP － 硼砂體系，添加表面活性劑0.25%triton X－100及有機(jī)溶劑0.25%DMF，運(yùn)行電壓為20 kV，進(jìn)樣壓力3.0 kPa，進(jìn)樣時(shí)間10 s，紫外吸收波長(zhǎng)224 nm.圖7是在最優(yōu)分離條件下對(duì)對(duì)照品混合液進(jìn)行電泳分離的CE譜圖.

2.7 工作曲線和檢出限

分別配制TR、QU和NA對(duì)照品混合樣，濃度在1.0×10－6～2 ×10－4g·mL－1.在最佳的電泳條件下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)行電泳分析，考察峰面積(Y)與對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)的線性關(guān)系.計(jì)算得到3種有效成分的回歸方程、r2、檢出限和線性范圍，列于表1.由表1可以看出，各分析物標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2均大于0.999;以信噪比為3確定3種組分的檢出限為 0.2 ～1.0 μg·mL－1.

文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜測(cè)定胡蘆巴中葫蘆巴堿［4］和槲皮素［11］的線性范圍分別是3.75 ～37.5 μg·mL－1和 0.184 ～3.68 μg·mL－1，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)定葫蘆巴堿的線性范圍是 3.0 ～200.0 μg·mL－1，檢測(cè)限 0.7 μg·mL－1，測(cè)定槲皮素的線性范圍 5.0 ～150.0 μg·mL－1.通過(guò)比較表明，所建立的方法線性范圍寬，檢測(cè)限低.

圖7 3種成分對(duì)照品的CE譜圖Fig.7 The electrophorograms of mixed standards

表1 線性關(guān)系和檢測(cè)限Tab.1 The regression equations and the detection limits

配制濃度為120 mmol·L－1的TR，50 mmol·L－1的QU 和90 mmol·L－1的NA 混合標(biāo)準(zhǔn)樣，在最優(yōu)條件下進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)分析5次，計(jì)算得到峰面積及遷移時(shí)間的RSD，列于表2.由表2可以看出，遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs，n=5)在1.5%以內(nèi);峰面積的RSDs(n=6)在5%以內(nèi).

2.8 樣品測(cè)定及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)條件下，采用工作曲線法定量分析提取后的胡蘆巴樣品，測(cè)得其中葫蘆巴堿、槲皮素和柚皮素的含量結(jié)果為28.6、2.7、45.6 μg·g－1，詳見(jiàn)表3.胡蘆巴實(shí)際樣品的電泳譜圖見(jiàn)圖8.從圖8中可知，樣品中的有效成分在最佳條件下均實(shí)現(xiàn)了分離.

表2 峰面積及遷移時(shí)間的精密度Tab.2 The repeatability of peak area and migration time(n=5)

表3 胡蘆巴干種子樣品中組分的含量Tab.3 Content of analytes in fenugreek samples(n=5)

分別向胡蘆巴樣品提取液中準(zhǔn)確地添加兩種質(zhì)量濃度的葫蘆巴堿、柚皮素及槲皮素的對(duì)照品混合液，使得所添加濃度為20.00和40.00 μg·mL－1，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算出回收率和精密度，列于表4.從表4可以看出，TR、NA和QU的平均回收率分別為95.5% ～111.2%，RSD為2.2% ～3.8%.回收率與精密度基本滿足胡蘆巴中3種有效成分的檢測(cè)要求.

圖8 葫蘆巴種子樣品CE譜圖Fig.8 The electrophorograms of real sample

表4 添加不同質(zhì)量濃度組分的回收率Tab.4 Recoveries for the analytes at different spiked levels(n=5)

［1］周淑晶.中藥葫蘆巴的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中藥研究與信息，2000，2(5):19－22.

［2］史江華，李多偉，逄敏杰，等.葫蘆巴研究新進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2007，22(3):153－155.

［3］劉廣學(xué)，尚明英，李輝，等.胡蘆巴藥材中胡蘆巴堿的提取方法及其含量測(cè)定［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6(4):11－14.

［4］吳延麗，李微，林鋒，等.大慶產(chǎn)胡蘆巴種子中生物堿及總黃酮成分的研究［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41(4):385－387.

［5］陳勇，沈少林，陳懷俠，等.HPLC－MSn法鑒定葫蘆巴堿及其在大鼠體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41(3):216－220.

［6］Wang Hai－yan，Lu Yu － chao，Chen Jie，et al.Subcritical water extraction of alkaloids in Sophora flavescens ait and determination by capillary electrophoresis with field － amplified sample stacking［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，58:146 －151.

［7］Yin Xiao－fang，Li Zhi，Zhang Shuai－h(huán)ua，et al.Determination of strychnine and brucine in traditional Chinese medicine preparations by capillary zone electrophoresis with micelle to solvent stacking［J］.Chinese Chemical Letters，2011，22:330 －333.

［8］Gan Zhi－bin，Chen Qi－wen，F(xiàn)u Yue－jiao，et al.Determination of bioactive constituents in flos sophorae immaturus and cortex fraxini by capillary electrophoresis in combination with far infrared － assisted solvent extraction［J］.Food Chemistry，2012，130:1 122－1 126.

［9］Dimitrova Pepa，Bart Hans－Jorg.Non－ionic surfactant modified ligand exchange chromatography using copper(II)complex of N，N －dimethyl－l－phenylalanine as the chiral additive for enantioselective amino acids separation［J］.Analytica Chimica Acta，2010，663:109－116.

［10］陳義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用［M］.2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:49.

［11］魯鑫焱，張超，趙懷清，等.不同產(chǎn)地胡蘆巴中總黃酮和槲皮素的含量測(cè)定［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21(6):430－433.