劉州洲，宋英攀，馮苗，詹紅兵

(福州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350116)

0 引言

鈦酸鹽是一種廣泛應(yīng)用于牙科材料以及化妝品的環(huán)境友好型材料.其納米結(jié)構(gòu)不僅具有優(yōu)良的生物相容性、導(dǎo)電性、化學(xué)和熱穩(wěn)定性，且制備簡單，通過水熱法即可獲得許多不同的結(jié)構(gòu)，如納米帶、納米線、納米管和納米花等［1－5］.酶生物電化學(xué)是近年來研究的熱點(diǎn)，作為酶電極材料，要有良好的生物相容性以及導(dǎo)電性，而鈦酸鹽納米材料由于表面微弱的負(fù)電荷有利于蛋白質(zhì)的吸附，且對吸附在其上的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性影響很?。?－7］，可望應(yīng)用于制備基于蛋白質(zhì)的生物電極材料.目前已有關(guān)于鈦酸鹽納米片和納米管的酶生物電化學(xué)性能的研究報(bào)道［8－11］.

鈦酸鹽納米帶(titanate nanobelts，TNBs)是一種新型鈦酸鹽納米結(jié)構(gòu)，具有鈦酸鹽納米材料的優(yōu)良性能，其高比表面積有利于吸附更多蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，在電極材料與目標(biāo)溶液間的電子轉(zhuǎn)移中起到重要作用，同時(shí)它又具有機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，是一種潛在的優(yōu)良電極表面修飾材料.鑒于目前尚無鈦酸鹽納米帶關(guān)于酶生物電化學(xué)性能的報(bào)道，擬對葡萄糖氧化酶(GOx)－Nafion－TNBs修飾電極的電化學(xué)性能展開研究.將TNBs與GOx的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、Nafion 按一定體積比混合后滴涂于玻碳電極表面，用循環(huán)伏安法對其進(jìn)行電化學(xué)研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

TiO2粉末(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，NaOH、HCl和乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，Nafion(低脂肪醇中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，美國Dupont公司)，GOx(50 KU生工生物工程有限公司，－20℃下保存)，葡萄糖(生工生物工程有限公司).

采用日本Rigaku Miniflex II型X射線衍射分析儀(CuKα，λ=0.153 06 nm，管電壓35 kV，工作電流25 mA)對樣品粉末進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析，采用美國FEI公司的Nova NanoSEM 230型掃描電子顯微鏡(SEM，加速電壓15 kV)和Tecnai G2 F20 S－TWIN型透射電子顯微鏡(TEM，加速電壓200 kV)對樣品進(jìn)行形貌表征，采用美國Perkin Elmer公司的FT－IR spectrum 2000紅外光譜儀(FT－IR)分析樣品結(jié)構(gòu).采用上海辰華的CHI620D型電化學(xué)工作站對電極進(jìn)行循環(huán)伏安法測試.

1.2 材料與修飾玻碳電極的制備及修飾電極電化學(xué)性能測試

TNBs由TiO2粉末通過水熱法在強(qiáng)堿溶液制備而成［4］.將0.9 g的TiO2粉末分散在NaOH溶液中(10 mol·L－1，50 mL)，將混合溶液倒入聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，在180℃下反應(yīng)72 h.將生成物用去離子水和0.1 mol·L－1的HCl水洗多次，得到的絮狀物在400℃下煅燒5 h，最終得到的產(chǎn)物為TNBs.

取2 mg經(jīng)表面處理的TNBs，分散在1 mL水中，超聲10 min.將GOx(10 mg)溶解于PBS(1 mL，50 mmol·L－1，pH 7.0)溶液中.采用體積比1∶1的水和乙醇將Nafion從5%稀釋至0.5%后，再將GOx－PBS溶液與Nafion和TNBs溶液按體積比1∶1∶2混合得到GOx－Nafion－TNBs溶液.所有溶液均在4℃下保存.

玻碳電極在修飾之前，先將其在金相砂紙上打磨并用二次蒸餾水充分沖洗，然后依次在1、0.3和0.05 μm的Al2O3懸濁液上拋光成鏡，拋光結(jié)束后依次用丙酮和二次蒸餾水超聲清洗5 min并在室溫下晾干.取6 μL的GOx－Nafion、GOx－Nafion－TNBs溶液，滴涂在玻碳電極上并于4℃下晾干，獲得表面修飾的玻碳電極.

電化學(xué)測試均采用三電極系統(tǒng)并且在室溫下進(jìn)行，參比電極為Ag/AgCl(飽和KCl溶液)，對電極為Pt絲，工作電極為經(jīng)過修飾的玻碳電極.采用循環(huán)伏安法PBS溶液(0.1 mmol·L－1，pH=7)中進(jìn)行.如需除氧時(shí)，將溶液通高純氬氣至少20 min，且實(shí)驗(yàn)時(shí)溶液保持在氬氣氣氛下，以防止空氣對電極工作時(shí)產(chǎn)生影響.

2 結(jié)果與討論

圖1 TNBs的SEM圖像(插圖:單根TNB的HRTEM)Fig.1 SEM image of the TNBs(inset:HRTEM image of a TNB)

圖2 TNBs的XRD圖譜Fig.2 XRD pattern of the TNBs

圖1為TNBs的電鏡照片.圖1顯示TNBs是單一的帶狀結(jié)構(gòu)，長度為3～5 μm，寬度為40～100 nm，從插圖可以看出，TNBs結(jié)晶良好，并且表面光滑沒有任何雜質(zhì).圖2為TNBs的XRD衍射圖譜，TNBs的最強(qiáng)峰2θ在10°附近.該鈦酸鹽的特征峰為10.2°、25°和29.7°，對應(yīng) Na2Ti3O7(JCPDS卡片號:72－0148).由于水洗過程中有部分Na+被H+置換出來，故推測該TNBs的化學(xué)組分為NaxH2－xTi3O［12］7.

圖3是TNBs的FT－IR光譜圖，其中1 622、906、696、495 cm－1是產(chǎn)物的特征峰.495 cm－1峰是兩個(gè)八面體的Ti－O－Ti的剛性振動引起的;696 cm－1是Ti－O－Na的振動;906 cm－1峰的出現(xiàn)是由4個(gè)等同的沒有鏈接Na原子的Ti－O鍵伸縮振動所引起的;1 622 cm－1為H－O－H的彎曲振動;3 158 cm－1為－OH的振動引起的，這是由于TNBs表面有－OH基團(tuán)的存在.由產(chǎn)物的FT－IR可以得出，該產(chǎn)物有Ti－O －Ti、Ti－O －Na、Ti－O 和表面的 Ti－OH 鍵存在［13］.

圖3 TNBs的FT－IR光譜圖Fig.3 FT － IR spectra of the TNBs

圖4 在PBS溶液中各電極的循環(huán)伏安曲線(掃描速率 100 mV.s－1)Fig.4 Cyclic voltammograms of the electrodes in PBS(scan rate 100 mV/s)

圖4為PBS溶液中各電極的循環(huán)伏安曲線(掃描速率100 mV·s－1).從圖4可見，GOx－Nafion電極在PBS溶液中出現(xiàn)微弱的氧化還原峰(曲線a)，這可能是因?yàn)樵谠撾姌O中電子轉(zhuǎn)移十分緩慢，或者是Nafion并不能吸附蛋白質(zhì)以至于GOx反應(yīng)時(shí)電子無法轉(zhuǎn)移出來［14］.而GOx－Nafion－TNBs電極存在一對氧化還原峰(曲線b).而在氬氣氣氛下(曲線c)，其還原峰電位的最大值在－0.514 V，氧化峰電位的最大值在 －0.452 V，峰位差(ΔEP)為0.062 V ，式量電位Eθ'= －0.483 V，表明固定在TNBs上的GOx能進(jìn)行直接電化學(xué)反應(yīng).由于TNBs表面存在游離態(tài)的H+，會與GOx中的FAD(flavin adenine dinucletide，黃素腺嘌呤二核苷酸)反應(yīng)生成還原型的FADH2，在O2存在的情況下，會促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，所以在空氣氣氛下的還原峰峰值電流最強(qiáng)，如反應(yīng)式(1)和(2).

因?yàn)镚Ox分子體積相對較大，其氧化還原中心即GOx(FAD)/GOx(FADH)電對深埋在酶分子內(nèi)部，與電極表面的距離超過了電子以足夠快速率進(jìn)行轉(zhuǎn)移的范圍，因此在裸電極上通常難以進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移［15］.GOx－Nafion－TNBs電極的強(qiáng)化電催化響應(yīng)起因有二:一是TNBs有良好的生物相容性和較大的表面積，能更多地吸附GOx分子，有利于大量的電子轉(zhuǎn)移;二是TNBs有良好的導(dǎo)電性，能夠在電極與酶分子間建立優(yōu)良的電子傳遞通道.

圖5為掃描速率100 mV·s－1時(shí)，在空氣氣氛下不同葡萄糖濃度的PBS溶液中GOx－Nafion－TNBs電極的循環(huán)伏安曲線.隨著葡萄糖濃度的增大，氧化與還原峰的峰值電流相應(yīng)減小.由于體系中存在游離態(tài)的H+會與GOx中的FAD反應(yīng)生成還原型的FADH2，在O2存在的情況下，還原型的FADH2會被O2氧化為FAD，如反應(yīng)式(1)、(2)所示.另一方面，葡萄糖是GOx催化的底物，將葡萄糖加入含有空氣的PBS溶液中時(shí)會發(fā)生GOx的催化反應(yīng)，將葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)脂，如反應(yīng)式(3)，從而導(dǎo)致電極表面的氧化型GOx減少，這樣會削弱反應(yīng)式(1)與(2)的進(jìn)行.因此，葡萄糖濃度增加會抑制電催化反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致還原峰電流減小，依此作為一種檢測葡萄糖濃度的有效手段.

圖6為含有15 mg·mL－1葡萄糖的PBS溶液中不同掃描速率GOx－Nafion－TNBs電極的循環(huán)伏安曲線(掃描速率50～250 mV·s－1)，由此得到其氧化還原峰所對應(yīng)的峰值電流與掃描速率之間的關(guān)系(插圖).可見，隨著掃描速率從50增加到250 mV·s－1，氧化還原峰所對應(yīng)的峰值電流與掃描速率幾乎呈線性遞增關(guān)系，ΔEp增加，但Eθ'幾乎不變，Eθ'=－0.434±0.004 V說明GOx的電催化反應(yīng)是一個(gè)表面控制過程，且GOx與TNBs牢固地固定在電極表面.峰間差非常小，說明電子轉(zhuǎn)移速度非常快，也說明了GOx均勻分散在 GOx－Nafion－TNBs電極表面.由插圖可計(jì)算出，Ipc=0.649 6+0.012 4v(R=0.995 μA).

由于nΔEP＜200 mV，根據(jù) Laviron公式［16］:

其中:R是氣體常數(shù);F是法拉第常數(shù);T是開氏溫度;轉(zhuǎn)移系數(shù)α取0.5，計(jì)算得出在50～250 m V·s－1時(shí)ks大約平均為4.97 s－1(25℃)，這表明TNBs能促進(jìn)GOx的直接電化學(xué)反應(yīng).

通過法拉第公式:Q=nFAΓ*(其中:Q為還原峰的積分面積，A為電極的工作面積，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，n為轉(zhuǎn)移的電子數(shù))，可以計(jì)算出電極表面酶的表觀吸附量Γ*.在本實(shí)驗(yàn)中，計(jì)算得出電極表面GOx的表觀吸附量Γ*=6.31×10－11mol·cm－2，顯示了GOx在TNBs構(gòu)成的三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的高吸附量，進(jìn)一步說明TNBs的存在有利于保持蛋白質(zhì)酶的生物活性，促進(jìn)GOx分子與電極之間的電子傳遞.

圖5 不同葡萄糖濃度下PBS溶液中GOx－Nafion－TNBs電極的循環(huán)伏安曲線(掃描速率100 m V·s－1)Fig.5 Cyclic voltammograms of GOx－Nafion－TNBs electrodes in PBS with different concentrations of glucose(scan rate 100 mV·s－1)

圖6 含有15 mg·L－1葡萄糖的PBS溶液中不同掃描速率GOx－Nafion－TNBs電極的循環(huán)伏安曲線(掃描速率50～250 mV·s－1)(插圖:氧化還原峰所對應(yīng)的峰值電流與掃描速率之間的關(guān)系)Fig.6 Cyclic voltammograms of the GOx－Nafion－TNBs electrode in PBS with 15 mg·L－1glucose at different scan rates(scan rates scan rates 50～250 mV·s－1)(Inset:plots of peak currents versus scan rates)

3 結(jié)語

采用水熱法制備出TNBs.制備的TNBs結(jié)構(gòu)為(NaxH2－xTi3O7)，表面帶有羥基基團(tuán)，長度為3～5 μm，寬度為40～100 nm.用TNBs吸附GOx制成葡萄糖生物傳感器.計(jì)算結(jié)果表明GOx－Nafion－TNBs修飾電極上的直接電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)為4.97 s－1，電極表面GOx表觀吸附量為6.31×10－11mol·cm－2.TNBs構(gòu)成的三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不僅可以為GOx提供一個(gè)穩(wěn)定的顯微工作環(huán)境，而且能與其牢固結(jié)合，并為電子從GOx轉(zhuǎn)移到電極表面提供一個(gè)快速通道，對其電化學(xué)性能起到積極的促進(jìn)作用.

由于TNBs的以上性能，我們期待基于TNBs復(fù)合材料的電化學(xué)生物傳感器在葡萄糖的檢測上有廣泛的應(yīng)用，并且能拓展第三代生物傳感器的電極材料的種類.

［1］Miao L，S Tanemura，Huang R，et al.Synthesis of cation － intercalated titanate nanobelts［J］.Journal of Nanoscience and Nanotechnology，2011，11:9 267－9 273.

［2］Li N，Zhang L D，Chen Y Z，et al.Highly efficient，irreversible and selective ion exchange property of layered titanate nanostructures［J］.Advanced Function Materials，2012，22:835 －841.

［3］Li N，Zhang L D，Chen Y Z，et al.Adsorption behavior of Cu(II)onto titanate nanofibers prepared by alkalitreatment［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，189:265 －272.

［4］Miao L，Ina Y，S Tanemura，et al.Fabrication and photochromic study of titanate nanotubes loaded with silver nanoparticles［J］.Surface Science，2007，13(601):2 797－2 799.

［5］Huang J Q，Cao Y G，Liu Z G，et al.Efficient removal of heavy metal ions from water system by titanate nanoflowers［J］.Chemical Engineering Journal，2012，180:75 －80.

［6］Topoglidis E，Cass A，Gilardi G，et al.Protein adsorption on nanocrystalline TiO2films:an immobilization strategy for bioanalytical devices［J］.Analytical Chemistry，1998，70(23):5 111 －5 113.

［7］Zhang L，Zhang Q，Lu X B，et al.Direct electrochemistry and electrocatalysis based on film of horseradish peroxidase intercalated into layered titanate nano － sheets［J］.Biosensors Bioelectronics，2007，23(1):102 －106.

［8］Dai H，Xu H F，Wu X P，et al.Electrochemical behavior of thionine at titanate nanotubes－based modified electrode:a sensing platform for the detection of trichloroacetic acid［J］.Talanta，2010，81(45):1 461 －1 466.

［9］Dai H，Lin Y，Wu X，et al.A new electrochemiluminescent sensing interface for clonazepam based on titanate nanotubes selfassembled film［J］.Sensors and Actuators:B，2010，145(1):320－326.

［10］Zhang L，Zhang Q，Li J H.Layered titanate nanosheets intercalated with myoglobin for direct electrochemistry［J］.Advanced Function Materials，2007，17(12):1 958 －1 965.

［11］Bao S J，Li C M，Zang J F，et al.New nanostructured TiO2for direct electrochemistry and glucose sensor applications［J］.Advanced Function Materials，2008，18(4):591 －599.

［12］Feng M，Zhan H B，Miao L.Facile solubilization of titanate nanobelts for nonlinear optical investigations［J］.Nanotechnology，2010，21:185 707－185 712.

［13］Huang J Q，Cao Y G，Wang M L，et al.Tailoring of low －dimensional titanate nanostructures［J］.Journal of Physical Chemistry C，2010，114:14 748－14 754.

［14］Wu，S，Ju H X，Liu Y.Conductive mesocellular silica－carbon nanocomposite foams for immobilization direct electrochemistry and biosensing of proteins［J］.Advanced Function Materials，2007，17(4):585 － 592.

［15］Yang M L，Wang J，Li H Q，et al.A lactate electrochemical biosensor with a titanate nanotube as direct electron transfer promoter［J］.Nanotechnology，2008，19(7):075 502 －075 507.

［16］Laviron E.General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems［J］.Journal of Electroanalytical Chemistry，1979，101(1):19－28.