孫維琦 張繼龍 鄭清川,* 孫志偉 張紅星

(1吉林大學公共衛(wèi)生學院,長春 130021;2吉林大學理論化學研究所,理論化學計算國家重點實驗室,長春 130023;3北華大學公共衛(wèi)生學院,吉林吉林 132013;4首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學院,北京 100069)

1 引言

二氧化碳是人體細胞內(nèi)糖類和脂肪代謝的副產(chǎn)物,必須及時從體內(nèi)清除.碳酸酐酶是與這一過程密切相關(guān)的一類重要含鋅金屬酶,它能夠催化二氧化碳和碳酸氫根離子的相互轉(zhuǎn)化.1雖然該反應(yīng)在無酶條件下也能發(fā)生,但碳酸酐酶將這個反應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率提高了一百萬倍.2人體內(nèi)大約70%的二氧化碳都是在這類酶的作用下代謝排出體外的.3除此之外,碳酸酐酶參與多種重要的生理過程,包括酸堿平衡,4骨骼的生長和功能,5代謝,6腫瘤胞外環(huán)境的酸化,7信號傳導和記憶等.8-10

碳酸酐酶II(CAII)是研究最廣泛的一種碳酸酐酶異構(gòu)酶,它大量存在于紅血球中,具有廣泛的組織分布.這個異構(gòu)酶也是目前已知的所有哺乳動物碳酸酐酶中最具有催化效率的,擁有接近擴散速度的催化速率.11除了代謝二氧化碳外,CA II催化的碳酸氫根的生成對于維持眼內(nèi)晶狀體壓力的平衡也具有重要的生理作用.12,13同時,骨骼石化癥14和絕經(jīng)期后的骨質(zhì)疏松癥也都和CAII的功能紊亂相關(guān).

芳基磺胺類藥物一直被作為重要的碳酸酐酶抑制劑,許多臨床上應(yīng)用的藥物都是通過苯磺酰胺作為母體發(fā)揮作用的(圖1).15盡管對這類藥物的研究已十分充分,但卻很少有研究關(guān)注它與碳酸酐酶的具體結(jié)合過程.在這方面,分子動力學模擬方法具有獨特的優(yōu)勢.16-19因此,本文以最基本的苯磺酰胺分子作為底物,通過多種分子動力學方法的綜合運用,從理論上探索苯磺酰胺分子與CA II的具體結(jié)合過程及原子水平上的相互作用,確定影響動態(tài)結(jié)合的重要氨基酸殘基.由于CA II具有整個碳酸酐酶家族的許多共性特征,因此當前的底物結(jié)合研究將具有普遍的意義.

圖1 碳酸酐酶II及其抑制劑苯磺酰胺的結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of carbonic anhydrase II and its inhibitor(phenylsulfonamide)

2 計算方法

2.1 常規(guī)分子動力學模擬

實驗上已經(jīng)獲得了碳酸酐酶II復合小分子磺胺抑制劑的X射線衍射晶體結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)收錄號為2WEJ.該結(jié)構(gòu)中包含了碳酸酐酶II(含有258個氨基酸殘基),一個鋅離子,基本磺胺單元,一個甘油分子和若干結(jié)晶水.甘油分子在模擬中被刪除，其它部分都保留.為了獲得穩(wěn)定的復合物結(jié)構(gòu)并進行充分的構(gòu)象空間取樣,首先執(zhí)行常規(guī)的分子動力學模擬.分子結(jié)構(gòu)中丟失的氫原子利用VMD程序20補充,然后利用其中的Solvate插件為復合物添加一個長方體的TIP3P溶劑水盒子,保證溶質(zhì)與水盒子邊界的最小距離不低于1 nm.濃度為154 mmol·L-1的Na+和Cl-被加入體系中以模擬生理條件同時中和體系自身的電荷.

采用PME方法21計算長程靜電相互作用,范德華相互作用在1.2-1.4 nm范圍內(nèi)逐漸減小為0.采用周期性邊界條件以模擬連續(xù)一致的行為.首先對整個體系進行10000步的共軛梯度(CG)能量最小化,該過程采用4184 kJ·mol-1·nm-2的諧振子勢函數(shù)限制蛋白骨架和磺胺分子的位置.然后保持限制,采用Langevin控溫法22將系統(tǒng)的溫度以5 ps·K-1的速度從100 K逐漸加熱到300 K,模擬時間步長設(shè)為1 fs.此后在1 ns的時間內(nèi)將限制勢逐漸減小到0.最后控制壓力為1.01325×105Pa,在NPT系綜下對體系進行10 ns的平衡模擬.最終得到的穩(wěn)定構(gòu)象被用于下一步的拉伸分子動力學計算.

2.2 拉伸分子動力學模擬及平均力勢的計算

拉伸分子動力學(SMD)方法是一種特殊的分子動力學模擬方法,能夠模擬配體-受體的脫離或結(jié)合過程,已成功應(yīng)用于許多相關(guān)研究中.20,21該方法可分為兩類:常速SMD和常力SMD.在本文中使用的是前者.常速SMD方法的基本原理是在配體的某一點上附著一個虛擬彈簧,彈簧另一端與一個無質(zhì)量的虛擬原子相連.在模擬過程中,使虛擬原子以設(shè)定的恒速移動,虛擬彈簧產(chǎn)生形變,其彈力即可反映配體-受體間的相互作用.在上述過程中,彈力F(t)可通過下式求得:

其中,k代表勁度系數(shù),v是虛擬原子的移動速度,x是作用點相對于初始位置的位移.

對于當前的研究體系來說,基于常規(guī)分子動力學模擬獲得穩(wěn)定復合構(gòu)象,我們固定金屬鋅離子和三個蛋白配位殘基(His94、His96和His119),將虛擬彈簧附著在磺胺小分子的質(zhì)心上,沿著底物與鋅的配位鍵方向進行拉伸模擬.動力學模擬步長為1 fs,軌跡每0.5 ps保存一次,拉力值每20 fs記錄一次.使用不同的隨機種子,拉伸模擬被重復三次進行驗證.

為了研究苯磺酰胺脫離過程的能量變化,我們基于SMD模擬獲得的脫離路徑上的特定結(jié)構(gòu)計算了沿脫離路徑的自由能變化.反應(yīng)坐標選為苯磺酰胺質(zhì)心與配位Zn2+之間的距離(0.4-1.8 nm).NAMD(nanoscalemoleculardynamics)中的自洽偏置力(ABF)方法23被用于計算對應(yīng)于該反應(yīng)坐標的平均力勢(PMF).為了提高計算效率,整個反應(yīng)坐標被分成長度為0.1 nm的若干個窗口.在每個窗口內(nèi)都運行長達2 ns的取樣模擬.最終得到的各段能量數(shù)據(jù)再通過一個附加的模擬進行聯(lián)合.

3 結(jié)果與討論

3.1 復合體系的穩(wěn)定性

當前研究所用的初始模型來源于X射線衍射晶體結(jié)構(gòu),其中必然存在著局部高勢能構(gòu)象,而這些構(gòu)象若不進行充分平衡將會影響接下來的SMD模擬.因此,碳酸酐酶II-磺胺復合體系首先經(jīng)過了10 ns的常規(guī)分子動力學模擬.蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是通過計算均方根偏差(RMSD)來表征的.圖2所示的就是10 ns的NPT模擬過程中,碳酸酐酶II的全原子以及骨架原子的RMSD隨模擬時間變化的曲線.從圖中可以看出,在該段模擬開始后的很短時間內(nèi),二者就分別穩(wěn)定在0.16、0.08 nm附近并做小幅度波動,證明蛋白的整體結(jié)構(gòu)已經(jīng)穩(wěn)定.此外,為了證明局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,當前研究也考察了金屬配位鍵的鍵長隨模擬時間的變化.結(jié)果表明,包括磺胺分子(通過磺?；牡优c鋅配位)在內(nèi)的四個配位鍵鍵長在NPT過程中保持很好的穩(wěn)定性且與晶體結(jié)構(gòu)中的鍵長十分接近,證明局部結(jié)構(gòu)也是穩(wěn)定的.

圖2 10 ns NPT模擬過程中碳酸酐酶II的全原子和骨架原子的均方根偏差(RMSD)Fig.2 Root mean square deviation(RMSD)profiles of all atoms and backbone atoms of CAII in the 10 ns NPT simulation

3.2 拉伸分子動力學模擬及PMF的計算

基于上述獲得的穩(wěn)定復合物構(gòu)象,拉伸分子動力學模擬被用于研究磺胺小分子從碳酸酐酶II中脫離的過程.對于拉伸分子動力學模擬來說,拉伸方向、拉伸速度和虛擬彈簧的勁度系數(shù)都對最終的拉力曲線有直接的影響.24-26磺胺小分子與碳酸酐酶II的結(jié)合構(gòu)象顯示,底物的脫離不存在多種不同的路徑,我們的模擬測試也證實了方向的差異對拉力曲線的影響不大.關(guān)于拉伸速度和勁度系數(shù),結(jié)合已有的類似模擬,16,24-26當前研究分別考察了三種不同的勁度系數(shù)(5000、350和1 pN·nm-1)和兩種不同拉伸速度(0.2和0.5 nm·ns-1)下得到的拉力曲線.不同的勁度系數(shù)會影響拉力曲線的表現(xiàn)并給出不同大小的峰值.當勁度系數(shù)為5000 pN·nm-1時,拉力曲線表現(xiàn)出很大的波動,導致拉力峰值難以分辨,并且拉力曲線的重現(xiàn)性不好;而1 pN·nm-1的勁度系數(shù)導致到達拉力峰值的時間變長,從而間接延長了模擬時間,因而也不適合當前模擬.處于二者之間的勁度系數(shù)(350 pN·nm-1)既可以保證較快的拉力增速,降低模擬時長,又能夠適度地消除拉力曲線的波動,給出很好的拉力重現(xiàn)性.在這個勁度系數(shù)下,兩個拉伸速度也被分別進行測試.當拉伸速度較小時(0.2 nm·ns-1),拉力峰值出現(xiàn)的時間較晚,模擬時間相對較長(超過10 ns);而0.5 nm·ns-1的拉伸速度可以在合理的時間內(nèi)模擬出整個脫離過程,因而是較合適的拉伸速度.

在350 pN·nm-1的勁度系數(shù)和0.5 nm·ns-1的拉伸速度下,當前研究對磺胺小分子底物從碳酸酐酶II中脫離的過程進行了三次重復的SMD模擬,每次選擇不同的隨機數(shù)以確保統(tǒng)計結(jié)果的科學性,所得的拉力曲線如圖3所示.從圖中可以看出,三條曲線彼此重合得很好,大約在8.8 ns附近,三條曲線達到了各自的峰值,分別為1438、1419和1421 pN,三者相對平均值表現(xiàn)出了小于1%的波動幅度,顯示了幾乎相同的脫離力.峰值之后,拉力曲線迅速降低,此時磺胺小分子脫離了碳酸酐酶II的活性位點進入水溶液環(huán)境中,拉力曲線在0附近上下波動,表現(xiàn)出底物分子在水中的受力情況.

圖3 拉伸分子動力學模擬過程中拉力隨時間的變化圖譜Fig.3 Time dependence of the applied force in the steered molecular dynamics(SMD)simulation

脫離過程中的自由能變化能夠反映出配體與受體相互作用的動態(tài)變化情況,給出脫離時的許多細節(jié)信息.基于SMD模擬的軌跡,我們計算得到了沿著上述反應(yīng)坐標的PMF變化圖(見圖4).圖中顯示,從反應(yīng)路徑的初始點,能量曲線即迅速上升,如此急劇的自由能消耗主要用于克服底物與金屬鋅的配位作用.直到反應(yīng)坐標達到0.50 nm時,能量的消耗達到了95 kJ·mol-1.此后能量曲線開始下降,在0.59 nm時達到一個局部極小值點,隨后又逐步升高,最后基本穩(wěn)定下來.從PMF模擬軌跡上觀察,底物開始進入溶劑是在反應(yīng)坐標0.59 nm處,此時底物基本脫離活性位點,但尚未完全進入水環(huán)境中,而僅僅是一部分與水發(fā)生相互作用.在PMF曲線中,0.59 nm后的曲線基本反映了底物小分子的溶解過程.故此,這個極小值點是底物脫離過程中一個特殊的結(jié)合狀態(tài).對該點底物與蛋白相互作用的研究能夠揭示影響底物結(jié)合的重要殘基的功能.

圖4 沿著底物脫離反應(yīng)坐標的PMF變化圖譜Fig.4 PMF profile along the reaction coordinate during the substrate's unbinding

3.3 磺胺小分子與酶的重要相互作用

磺胺小分子脫離碳酸酐酶II的整個過程已經(jīng)通過SMD模擬及PMF的計算清晰地呈現(xiàn)出來,這為研究脫離路徑上的關(guān)鍵氨基酸殘基提供了可能.通過考察軌跡,當前研究詳細分析了整個脫離過程中底物小分子和碳酸酐酶II重要殘基的相互作用情況.首先,整個底物脫離過程中小分子與酶總相互作用能的計算結(jié)果顯示,靜電相互作用能對總相互作用能的貢獻占80%左右.這表明,靜電相互作用占據(jù)主導地位,能夠極大地影響小分子與酶的結(jié)合.這與小分子的性質(zhì)和酶的活性位點密切相關(guān).當前研究中選取的底物是苯磺酰胺分子,這個分子的氨基上帶有一個負電荷(圖1),與碳酸酐酶II活性位點處的金屬鋅離子以及底物附近的帶電殘基之間存在著強烈的靜電力,從而導致了靜電作用遠遠大于范德華相互作用.

圖5 苯磺酰胺分子和三個重要殘基之間的總相互作用能Fig.5 Profiles of the total interaction energy between phenylsulfonamide molecule and three important residues

聯(lián)合上述的PMF計算結(jié)果,所有影響底物與酶結(jié)合的重要氨基酸殘基也通過相互作用能的計算來進行判斷.在底物脫離路徑上的所有氨基酸殘基中,Leu198、Thr199和Thr200是三個最重要的殘基.相互作用能的計算顯示,這三個殘基與苯磺酰胺之間的相互作用能遠遠大于其它路徑上的殘基,并且都是以靜電作用為主導的.圖5給出的是它們與小分子相互作用能隨著SMD模擬時間的變化圖譜.從中可以看出,在三個殘基中,Leu198與底物的相互作用在SMD模擬的大部分時間內(nèi)遠小于另外兩個殘基且多有不利于底物結(jié)合的情況發(fā)生.但這個殘基在底物分子即將脫離碳酸酐酶II的時刻,與其相互作用急劇降低,阻礙了底物的離去,因此是影響底物結(jié)合的一個重要殘基.而對于Thr199和Thr200來說,二者在大多數(shù)情況下均和苯磺酰胺分子存在很強的相互作用,其中以Thr200作用更強.雖然在底物分子脫離時刻這兩個殘基沒有出現(xiàn)如Leu198那樣的強烈阻礙作用,但因為它們與底物長時間較大的相互作用,所以也是影響底物結(jié)合或脫離的關(guān)鍵氨基酸殘基.除了上述這三個殘基外,其它一些殘基與底物分子也有較強的作用.例如,Asn62和Ala65,這兩個殘基在底物脫離時刻與之的相互作用也分別達到了-27.2和-19.2 kJ·mol-1,并且二者也都是以靜電作用為主的.此外,活性位點鋅離子的配位殘基(His94,His96和His119)則由于靜電作用對底物的脫離起到促進作用.與底物存在較強范德華相互作用的殘基是Val121,對于這個殘基來說,靜電作用和范德華相互作用在數(shù)值上相差不大,都在-8.4 kJ·mol-1附近,由此可見,這個殘基與底物的苯環(huán)之間存在較強的作用.

圖6 底物脫離過程中苯磺酰胺分子和重要殘基之間的原子水平相互作用情況Fig.6 Atomic level interaction between phenylsulfonamide and the important residues in the process of the substrate

能量的計算不能揭示底物分子脫離碳酸酐酶II時原子水平上的作用情況.因此,當前研究詳細考察了PMF模擬軌跡中底物與酶的作用,其中脫離過程關(guān)鍵點的相互作用情況如圖6所示.在這一位置處(對應(yīng)于PMF曲線的波谷點),苯磺酰胺分子與酶殘基存在多條氫鍵,分別為底物氨基氫與Thr199的支鏈羥基氧之間的一個氫鍵和底物磺酰基氧與殘基Thr200的支鏈羥基氫和主鏈氨基氫之間的兩個氫鍵,而這個磺酰氧雖然沒有與Thr199的主鏈氨基氫形成氫鍵,但兩個原子之間的距離并不太遠,因此可以斷定它們之間的相互作用也是相當強的.而苯磺酰胺分子與Leu198之間的相互作用則發(fā)生在模擬的后續(xù)階段,主要是磺酰氧與這個殘基主鏈氨基氫之間的作用.

對模擬軌跡的考察也揭示了磺胺小分子底物脫離碳酸酐酶II整個過程中的酶和小分子的變化.對于碳酸酐酶II來說,底物小分子脫離之前,其活性位點處的鋅離子分別與His94、His96、His119和苯磺酰胺配位;底物脫離后,一個外來的水分子進入活性位點中,占據(jù)了原來配體的位置與鋅離子形成配位鍵.碳酸酐酶II的其它殘基沒有發(fā)生較大的構(gòu)象變化,這源于該酶較強的活性位點剛性特征.8對于底物小分子來說,脫離初始階段它始終保持著磺?；蚧钚晕稽c方向,而其苯環(huán)則指向活性位點外的溶液環(huán)境.脫離后,由于磺酰基團的親水性,底物發(fā)生翻轉(zhuǎn),苯環(huán)朝向活性位點方向,而磺酰胺部分朝向水溶劑,以利于磺?；c溶劑水分子的作用.

4 結(jié)論

磺胺類藥物分子與碳酸酐酶II的結(jié)合或脫離除了受到活性位點殘基的影響外,那些在底物結(jié)合路徑上的殘基也起到不可忽視的作用.對于磺胺類抑制劑來說,以苯磺酰胺為例的模擬揭示了這類底物與酶之間的靜電相互作用對于小分子與酶的結(jié)合起到關(guān)鍵角色.在結(jié)合路徑上的三個關(guān)鍵氨基酸殘基Leu198、Thr199和Thr200通過與底物的磺酰胺部分形成氫鍵,從而阻礙底物的離去.

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