白 姝 李 浩 張 麟

(天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，天津300072; 天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072)

1 引言

基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展推動(dòng)重組蛋白質(zhì)藥物在微生物體內(nèi)的大規(guī)模生產(chǎn).1-3但是，重組蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中的高水平表達(dá)往往導(dǎo)致其發(fā)生錯(cuò)誤的折疊和聚集，4形成被稱為包含體(inclusion body)的無(wú)活性聚集體，需要通過(guò)蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程使其恢復(fù)天然構(gòu)型和生物學(xué)活性.5，6因此，蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)開(kāi)發(fā)和理論完善對(duì)蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)具有重要意義.7

蛋白質(zhì)復(fù)性的最大挑戰(zhàn)就是創(chuàng)造合適的復(fù)性條件，最大程度地抑制聚集體生成，從而提高復(fù)性收率.8而現(xiàn)階段重組蛋白質(zhì)復(fù)性仍存在收率低，操作條件較為嚴(yán)苛等問(wèn)題.近期，Wang等9通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，帶有正電荷的離子交換介質(zhì)Q和DEAE Sepharose FF可以顯著促進(jìn)帶正電的溶菌酶復(fù)性，而帶有負(fù)電荷的離子交換介質(zhì)SP和CM Sepharose FF可以顯著促進(jìn)帶負(fù)電的牛血清白蛋白復(fù)性，并推斷與蛋白質(zhì)帶有同種電荷的離子交換介質(zhì)可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在介質(zhì)表面形成定向排列.此定向排列促使蛋白質(zhì)之間的靜電排斥力增大，從而抑制蛋白質(zhì)的聚集而促進(jìn)復(fù)性.但是，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究很難直接證實(shí)此機(jī)理.而分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬10，11能夠直接提供系統(tǒng)的微觀結(jié)構(gòu)信息，并能通過(guò)數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)等手段計(jì)算系統(tǒng)的宏觀性質(zhì)，已經(jīng)成為與理論研究和實(shí)驗(yàn)研究并行互補(bǔ)的科學(xué)研究手段，廣泛用于蛋白質(zhì)相關(guān)領(lǐng)域的研究.12迄今為止，已有大量研究者通過(guò)分子模擬研究界面吸引誘導(dǎo)的小分子13，14和蛋白質(zhì)15-23吸附行為，但很少研究界面排斥作用誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)空間分布.

因此，本文將構(gòu)建靜電排斥表面模型以模擬帶同種電荷的離子交換介質(zhì)，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬考察蛋白質(zhì)與靜電排斥表面之間的相互作用過(guò)程，展示蛋白質(zhì)在靜電排斥表面上的空間取向和構(gòu)象轉(zhuǎn)換，考察表面所帶電荷數(shù)的影響規(guī)律，揭示同電荷離子交換介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的微觀機(jī)理，推動(dòng)蛋白質(zhì)在荷電表面折疊和分子相互作用研究.

2 模擬方法

2.1 模擬體系構(gòu)建

根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb/)中的晶體衍射結(jié)構(gòu)(PDB ID:3LYZ)構(gòu)建溶菌酶的全原子模型，24如圖1A所示.溶菌酶由129個(gè)殘基組成，pH=7時(shí)帶8個(gè)正電荷(包括17個(gè)帶正電荷的殘基和9個(gè)帶負(fù)電荷的殘基).

本文構(gòu)建靜電排斥表面模型以模擬同電荷離子交換介質(zhì)，包括基質(zhì)和配基兩部分(參比體系只含基質(zhì)).基質(zhì)由正六邊形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的平板表示，其中正六邊形的邊長(zhǎng)為0.152 nm.配基的原子組成參照商業(yè)化介質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)(https://www.gelifesciences.com/)確定，其鍵長(zhǎng)、鍵角和二面角及其力常數(shù)等結(jié)構(gòu)參數(shù)由PRODRG 2.5(http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cig-bin/prodrg_beta)25生成，而原子的部分電荷通過(guò)量子化學(xué)計(jì)算和類似結(jié)構(gòu)比對(duì)調(diào)整確定，標(biāo)示于圖1B中.其后，將配基連接到基質(zhì)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整配基密度為0.22 mmol·mL-1，如圖1C所示.

圖1 溶菌酶和靜電排斥表面的全原子模型Fig.1 All-atom models of the lysozyme and the surface with electrostatic repulsion

構(gòu)建模擬體系時(shí)，首先將靜電排斥表面放入6.84 nm×6.91 nm×18.00 nm的長(zhǎng)方體盒子底部(參比體系的盒子高度為10.00 nm).然后將1個(gè)溶菌酶分子放置于表面上方，其質(zhì)心距離表面約2 nm.進(jìn)而添加水分子，并添加適量反離子使模擬體系呈電中性.最后將模擬體系放入6.84 nm×6.91 nm×100 nm的長(zhǎng)方體盒子中心進(jìn)行模擬.本文共構(gòu)建4個(gè)模擬體系，包括靜電排斥表面體系(標(biāo)記為Q)，參比體系(標(biāo)記為control)，介質(zhì)所帶電荷增大30%(標(biāo)記為1.3Q)和減小25%(標(biāo)記為0.75Q，體系高度為12 nm)的體系，其具體組成列于表1.

2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)模擬利用GROMACS 4.0.5程序(http://www.gromacs.org/)26，27完成，使用GROMOS96 43A1力場(chǎng).28模擬采用NVT系綜，通過(guò)v-rescale溫度偶聯(lián)法29控制溫度為298.15 K.采用半步蛙跳法積分，步長(zhǎng)為2 fs.靜電相互作用計(jì)算采用PME(particle-mesh Ewald)算法，其截?cái)嗑嚯x設(shè)為1.2 nm.范德華作用計(jì)算采用cut-off算法，其截?cái)喟霃皆O(shè)為1.2 nm.近鄰原子列表截?cái)喟霃皆O(shè)為1.2 nm.粒子運(yùn)動(dòng)的初始速度根據(jù)模擬溫度298.15 K下的Maxwell分布產(chǎn)生.對(duì)模擬盒子施加x，y，z的三個(gè)方向的周期性邊界條件.

本文采用最速下降法進(jìn)行能量最小化，能量閥值設(shè)置為2000 kJ·mol-1.然后，進(jìn)行20 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，得到模擬軌跡用于后續(xù)分析.為了保證模擬結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文中對(duì)體系Q執(zhí)行3次平行模擬.所有模擬均使用曙光TC2600刀片服務(wù)器完成.文中蛋白質(zhì)構(gòu)象圖利用RASMOL軟件30繪制.

2.3 數(shù)據(jù)分析方法

2.3.1 蛋白質(zhì)空間取向分析

本文定義角度θ為蛋白質(zhì)的偶極和z坐標(biāo)軸之間的夾角，以定量描述蛋白質(zhì)在靜電排斥表面上的空間取向.當(dāng)θ=0°時(shí)，蛋白質(zhì)的偶極垂直于靜電排斥表面(平行于+z坐標(biāo)軸).當(dāng)θ為90°或-90°時(shí)，蛋白質(zhì)的偶極平行于靜電排斥表面(偶極指向+x方向定義為正).通過(guò)自編程序計(jì)算蛋白質(zhì)的θ值隨模擬時(shí)間的變化.

表1 模擬體系的參數(shù)Table 1 Parameters of simulation systems

2.3.2 分子間勢(shì)能分析

利用GROMACS軟件包的g_energy程序進(jìn)行勢(shì)能分析，包括Lennard-Jones(LJ)勢(shì)能(標(biāo)記為ELJ)和庫(kù)侖勢(shì)能(標(biāo)記為EC).

2.3.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

為了描述MD模擬過(guò)程中蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)化，利用Define Secondary Structure of Proteins(DSSP)方法31及GROMACS軟件包的do_dssp程序完成其二級(jí)結(jié)構(gòu)分析.

2.3.4 均方根偏差計(jì)算

利用GROMACS軟件包的g_rms程序計(jì)算溶菌酶分子相比于其天然結(jié)構(gòu)的均方根偏差(RMSD)，如式(1)所示.RMSD值越小，表明溶菌酶天然結(jié)構(gòu)保持更好.

2.3.5 回轉(zhuǎn)半徑計(jì)算

利用GROMACS軟件包的g_gyrate程序計(jì)算溶菌酶的回轉(zhuǎn)半徑(Rg)以描述其結(jié)構(gòu)緊密程度，如式(2)所示.Rg值越小，表明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)越緊密.

2.3.6 自由能表面圖

參照文獻(xiàn)20，32計(jì)算蛋白質(zhì)處于特定θ和zcom的概率分布P(θ，zcom)，其中zcom為蛋白質(zhì)質(zhì)心的z坐標(biāo)值.通過(guò)模擬軌跡采樣和自編程序計(jì)算完成.

3 結(jié)果與討論

3.1 溶菌酶空間取向分析

首先通過(guò)系統(tǒng)快照(snapshots)直觀分析模擬體系的微觀構(gòu)象隨模擬時(shí)間的變化，包括溶菌酶的構(gòu)象，空間取向以及位置等，如圖2所示.此處，著重分析溶菌酶的偶極取向，偶極已放大以便清晰顯示，在圖中以棒狀標(biāo)出，其偶極方向由紅色指向藍(lán)色(印刷版中由黑色指向灰色).注意，此處僅顯示一條典型軌跡結(jié)果，其余平行模擬軌跡的分析結(jié)果一致，故略去.

圖2 溶菌酶在靜電排斥表面上的構(gòu)象隨模擬時(shí)間變化圖Fig.2 Snapshots of lysozyme over the surface with electrostatic repulsion as a function of simulation time

圖2A顯示，溶菌酶的初始位置靠近靜電排斥表面，其偶極方向接近平行方向，溶菌酶含有豐富的α-螺旋和β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu).其后，蛋白質(zhì)受到表面的排斥作用而遠(yuǎn)離.2 ns時(shí)，蛋白質(zhì)已經(jīng)遠(yuǎn)離表面并呈現(xiàn)“站立”姿勢(shì)，其偶極方向接近垂直方向.此時(shí)蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)被拉伸，其二級(jí)結(jié)構(gòu)部分喪失而轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬?duì)柔性的卷曲結(jié)構(gòu).6 ns時(shí)，蛋白質(zhì)依然遠(yuǎn)離表面，其偶極方向有輕微偏轉(zhuǎn)，但依然接近垂直方向，即蛋白質(zhì)一直保持“站立”姿勢(shì).其后，由于蛋白質(zhì)遠(yuǎn)離表面，且偶極旋轉(zhuǎn)會(huì)進(jìn)一步降低表面對(duì)其的排斥作用，蛋白質(zhì)可以再次靠近表面.例如，12 ns時(shí)，蛋白質(zhì)略微靠近表面，而其偶極旋轉(zhuǎn)到幾乎完全垂直的方向，表明蛋白質(zhì)靠近表面時(shí)，靜電相互作用增強(qiáng)利于誘導(dǎo)形成“站立”姿勢(shì).但同時(shí)也需注意，20 ns時(shí)，蛋白質(zhì)進(jìn)一步接近表面，但其偶極反而偏離垂直方向，表明蛋白質(zhì)的取向還受到其他因素，如溶劑的影響，存在一定波動(dòng).

在參比體系(圖2B)中，由于表面呈電中性，和蛋白質(zhì)之間不存在靜電相互作用.因此，蛋白質(zhì)一直保持在表面附近，在溶劑作用下存在一定的移動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，但其偶極方向變化并無(wú)明顯規(guī)律.同時(shí)，在參比體系中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)一直很好保持，表明蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)在溶液中比較穩(wěn)定.

因此，微觀構(gòu)象分析表明，靜電排斥表面推動(dòng)蛋白質(zhì)遠(yuǎn)離.在此過(guò)程中，表面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)逐漸“站立”，使其偶極保持在垂直于表面的方向.盡管蛋白質(zhì)的偶極方向存在一定的擺動(dòng)，但總體而言都接近垂直方向，即蛋白質(zhì)基本保持“站立”姿勢(shì).

進(jìn)而考察角度θ(定義和計(jì)算流程見(jiàn)2.3.1節(jié))的變化以定量描述蛋白質(zhì)在靜電排斥表面作用下的空間取向分布及其變化情況，同時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)質(zhì)心的z坐標(biāo)值定量描述蛋白質(zhì)與表面的相對(duì)位置變化，如圖3所示.此處，體系Q的數(shù)據(jù)為3次平行模擬結(jié)果的平均值.

在靜電排斥表面上，蛋白質(zhì)的θ值從初始的-105°迅速變化到0°左右，即蛋白質(zhì)從“平躺”姿勢(shì)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢玖ⅰ弊藙?shì).同時(shí)其zcom迅速增大，表明蛋白質(zhì)迅速遠(yuǎn)離表面.相比而言，zcom變化更緩慢，即其變化速率小于θ的變化速率，表明蛋白質(zhì)在受到排斥而遠(yuǎn)離表面的過(guò)程中即已形成“站立”姿勢(shì).在2 ns附近時(shí)，蛋白質(zhì)的zcom呈現(xiàn)峰值，此時(shí)蛋白質(zhì)的θ在0°附近波動(dòng)，但都維持在-60°到60°的區(qū)間內(nèi)，表明蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)離表面時(shí)，由于靜電排斥減弱，蛋白質(zhì)的偶極方向存在一定的擺動(dòng).其后，蛋白質(zhì)的zcom值略微降低，在3.0到5.5 ns期間呈現(xiàn)平臺(tái)期，其zcom值維持在8 nm，而此時(shí)蛋白質(zhì)的θ值基本維持在0°，表明蛋白質(zhì)依然很好維持“站立”姿勢(shì).此后，蛋白質(zhì)略微接近表面，而θ值的變化幅度增大，但依然維持在0°附近.到12 ns后，蛋白質(zhì)的θ值變化幅度進(jìn)一步增大，表明蛋白質(zhì)從遠(yuǎn)離靜電排斥表面的位置逐漸靠近表面時(shí)，由于靜電排斥作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的偶極方向需要重新調(diào)整以達(dá)到新的平衡狀態(tài).其概率分布(圖3B)表明，蛋白質(zhì)的zcom主要介于5到10 nm之間，表明蛋白質(zhì)受到排斥而遠(yuǎn)離表面，其θ角主要分布于-60°到60°之間，確證蛋白質(zhì)形成“站立”姿勢(shì).

圖3 溶菌酶空間取向和位置隨模擬時(shí)間變化圖Fig.3 Orientation and the location of lysozyme as a function of simulation time

在參比體系中，蛋白質(zhì)一直維持在表面附近，其zcom值變化較小，可以認(rèn)為蛋白質(zhì)只是在其初始位置附近波動(dòng)而并無(wú)明顯移動(dòng)(圖3C的統(tǒng)計(jì)結(jié)果給出明確證據(jù)).在模擬初始階段，蛋白質(zhì)的θ值也無(wú)明顯變化，只是在其初始值附近波動(dòng).2.5 ns后蛋白質(zhì)的θ值發(fā)生明顯變化，但分析表明都是無(wú)規(guī)的轉(zhuǎn)動(dòng)導(dǎo)致，從圖2的系統(tǒng)快照中也可得到直觀證明.15 ns后，蛋白質(zhì)的偶極方向又恢復(fù)到初始狀態(tài)并存在輕微波動(dòng).

因此，θ值和zcom值隨模擬時(shí)間的變化確證蛋白質(zhì)在靜電排斥表面作用下迅速遠(yuǎn)離，而在遠(yuǎn)離過(guò)程中其偶極旋轉(zhuǎn)，形成特定的“站立”姿勢(shì).此結(jié)果直接驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)推測(cè)，表明蛋白質(zhì)確實(shí)在靜電排斥表面形成定向排布，有助于增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的靜電排斥作用而抑制溶菌酶聚集.但同時(shí)需注意，蛋白質(zhì)和表面間的距離，以及溶劑均影響蛋白質(zhì)的偶極方向使其存在一定的擺動(dòng).

然后，通過(guò)蛋白質(zhì)和表面間相互作用勢(shì)能分析，考察蛋白質(zhì)形成特定“站立”姿勢(shì)的關(guān)鍵作用力，如圖4所示.此處，體系Q的數(shù)據(jù)為3次平行模擬結(jié)果的平均值.

圖4 溶菌酶和介質(zhì)間的LJ勢(shì)能和庫(kù)侖勢(shì)能隨模擬時(shí)間變化圖Fig.4 Lennard-Jones(LJ)and Coulomb potential energies between lysozyme and resin as a function of simulation time

僅在模擬初始階段觀察到靜電排斥表面和蛋白質(zhì)之間存在很小的LJ勢(shì)能，約-1.2 kJ·mol-1.其后，LJ勢(shì)能持續(xù)為0，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)被排斥遠(yuǎn)離表面(圖3)而LJ勢(shì)能是短程相互作用，隨距離迅速衰減.而蛋白質(zhì)和表面之間存在很大的靜電相互作用勢(shì)能，接近140 MJ·mol-1.靜電相互作用勢(shì)能隨模擬時(shí)間迅速減小，到2 ns附近時(shí)達(dá)到最小值83 MJ·mol-1，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在靜電排斥作用下迅速遠(yuǎn)離表面(圖3)，使靜電勢(shì)能迅速降低.其后，隨著蛋白質(zhì)再次靠近表面(圖3)，蛋白質(zhì)和表面間的靜電相互作用勢(shì)能再次上升，最終達(dá)到105 MJ·mol-1.而在參比體系中，蛋白質(zhì)與表面之間的LJ勢(shì)能和靜電作用勢(shì)能都基本為0，因而表面對(duì)蛋白質(zhì)并無(wú)作用，蛋白質(zhì)呈現(xiàn)溶液主體行為，與圖2和圖3的結(jié)果完全吻合.

因此，通過(guò)勢(shì)能分析可以確證，表面通過(guò)靜電排斥作用驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)遠(yuǎn)離并誘導(dǎo)其形成特定“站立”姿勢(shì).為驗(yàn)證此結(jié)論，本文還構(gòu)建帶負(fù)電的靜電表面，發(fā)現(xiàn)帶正電的溶菌酶分子在靜電吸引作用下直接吸附于負(fù)電表面(數(shù)據(jù)未顯示).如果通過(guò)調(diào)整溶液pH值使溶菌酶也帶負(fù)電(如pH=14)，則溶菌酶同樣在靜電排斥作用下迅速遠(yuǎn)離，再次確證靜電排斥作用是關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力.但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，pH=14時(shí)，溶菌酶中只有帶負(fù)電的氨基酸殘基而無(wú)帶正電的氨基酸殘基，無(wú)法形成明顯偶極而導(dǎo)致無(wú)法形成特定“站立”姿勢(shì)(數(shù)據(jù)未顯示)，表明正負(fù)電荷的不均勻分布是特定“站立”姿勢(shì)形成的關(guān)鍵因素.

3.2 溶菌酶構(gòu)象分析

利用DSSP方法確定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)隨模擬時(shí)間的變化，如圖5所示.結(jié)果表明，溶菌酶的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)是α-螺旋，間雜零星β-折疊結(jié)構(gòu).參比體系中，各顏色條帶隨模擬進(jìn)行都比較穩(wěn)定.例如，10號(hào)殘基、30號(hào)殘基和95號(hào)殘基處的α-螺旋在模擬過(guò)程中一直保持完好，而110號(hào)殘基處的α-螺旋結(jié)構(gòu)存在短暫消失的情況，但很快重新生成，且一直維持到模擬終點(diǎn)，表明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)得到很好保持.

但在靜電排斥表面體系中，各顏色條帶均存在消失或增加的反復(fù)過(guò)程，總體呈現(xiàn)不連續(xù)分布狀態(tài)，表明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在明顯變化.其變化細(xì)節(jié)表明蛋白質(zhì)中多處的α-螺旋結(jié)構(gòu)喪失.參照?qǐng)D2的系統(tǒng)快照分析，在靜電排斥表面作用下，蛋白質(zhì)中帶正電荷的殘基受到排斥而試圖遠(yuǎn)離表面，但帶負(fù)電荷的殘基受到吸引而試圖靠近表面，因此蛋白質(zhì)受力不均而被輕微拉伸，其內(nèi)部原子相對(duì)位置的變化造成其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞.從圖5中也可看出，帶電殘基處的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最為劇烈.例如，天然溶菌酶中ARG5-LYS13形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，在參比體系中此結(jié)構(gòu)很好保持(圖5B).而在靜電排斥表面體系中，由于ARG5和LYS13均帶電，受到表面的影響而導(dǎo)致此螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，甚至整體螺旋結(jié)構(gòu)被破壞(圖5A).同時(shí)需注意，隨著蛋白質(zhì)位置和偶極方向的調(diào)整，蛋白質(zhì)構(gòu)象也存在細(xì)微調(diào)整過(guò)程.

因此，計(jì)算蛋白質(zhì)的RMSD和Rg值模擬時(shí)間的變化，以通過(guò)結(jié)構(gòu)偏差程度及其整體結(jié)構(gòu)緊密程度(詳見(jiàn)2.3節(jié)中數(shù)據(jù)分析方法描述)定量考察蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，如圖6所示.此處數(shù)據(jù)為3次平行模擬結(jié)果的平均值.

參比體系中，蛋白質(zhì)的RMSD值在模擬開(kāi)始時(shí)輕微增大，表明蛋白質(zhì)在溶液環(huán)境中存在細(xì)微結(jié)構(gòu)調(diào)整，其后則一直在0.10 nm上下波動(dòng).蛋白質(zhì)的Rg值隨模擬時(shí)間輕微降低，然后維持在1.35 nm上下波動(dòng).二者的數(shù)值都很小且波動(dòng)幅度也很小，表明參比體系中蛋白質(zhì)并無(wú)明顯構(gòu)象變化，與圖2的系統(tǒng)快照和圖5的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致.

而在靜電排斥表面體系中，蛋白質(zhì)的RMSD值在模擬初始階段即迅速增大，并進(jìn)而維持在0.5 nm上下波動(dòng)且持續(xù)到模擬終點(diǎn)，表明蛋白質(zhì)確實(shí)在模擬初始的排斥遠(yuǎn)離過(guò)程中受到很大的結(jié)構(gòu)擾動(dòng)，使其結(jié)構(gòu)明顯偏離天然態(tài).蛋白質(zhì)的Rg值在模擬初始階段也迅速上升，高于參比體系，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)確實(shí)被拉伸而使其整體結(jié)構(gòu)松散.其后，Rg值很快下降到與參比體系相當(dāng)，進(jìn)而繼續(xù)下降并穩(wěn)定在1.30 nm上下波動(dòng)，其穩(wěn)定值低于參比體系中的Rg值.綜合RMSD值和Rg值的變化表明蛋白質(zhì)被排斥遠(yuǎn)離表面后，由于距離增大(圖3)導(dǎo)致靜電排斥力減弱(圖4)，蛋白質(zhì)受到外界干擾減小，開(kāi)始構(gòu)象調(diào)整，呈現(xiàn)整體塌縮的變化趨勢(shì).然而，蛋白質(zhì)的最終結(jié)構(gòu)仍然偏離天然結(jié)構(gòu)，但其偏差數(shù)值并不大，表明其最終骨架結(jié)構(gòu)還能較好保持，與圖2的系統(tǒng)快照分析結(jié)果一致.因而，靜電排斥表面對(duì)溶菌酶的分子結(jié)構(gòu)有一定擾動(dòng)，盡管整體骨架結(jié)構(gòu)變化不大，也可能造成其活性喪失.

因此，綜合分析二級(jí)結(jié)構(gòu)，RMSD和Rg值的結(jié)果表明，參比體系中，蛋白質(zhì)的構(gòu)象很好保持.而在靜電排斥表面體系中，蛋白質(zhì)由于受力不均，存在先拉伸后塌縮的變化過(guò)程，其二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，但主體骨架結(jié)構(gòu)較好保持.

3.3 表面所帶電荷數(shù)的影響分析

圖5 分子動(dòng)力學(xué)模擬中溶菌酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)演化Fig.5 Secondary structure evolution of lysozyme during the molecular dynamics simulation

上述結(jié)果表明，靜電排斥表面能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成“站立”姿勢(shì)，而靜電排斥作用是主要驅(qū)動(dòng)力.因此，表面所帶電荷數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的空間取向應(yīng)該具有重要影響.本文構(gòu)建電荷數(shù)增大的靜電排斥表面模型(1.3Q)以及電荷數(shù)減小(0.75Q)的模型，分析其與蛋白質(zhì)的相互作用及其對(duì)蛋白質(zhì)的空間取向和構(gòu)象變化的影響，如圖7、8、9所示.

圖7顯示，在體系1.3Q中，蛋白質(zhì)的θ值一直維持在0°上下波動(dòng)，且波動(dòng)幅度很小，表明表面所帶電荷數(shù)增大使其靜電排斥作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)能夠更好形成并保持“站立”姿勢(shì).蛋白質(zhì)的zcom值迅速增大，到6 nm處增大變緩，最終維持在10 nm上下波動(dòng).其概率分布(圖7B)表明，蛋白質(zhì)的θ角更集中于-60°到60°之間.因此，相比于體系Q(圖3)，蛋白質(zhì)的排斥遠(yuǎn)離過(guò)程更快且最終穩(wěn)定距離更遠(yuǎn)，但其“站立”姿勢(shì)也更穩(wěn)定，表明表面所帶電荷數(shù)增大確實(shí)有利于蛋白質(zhì)的“站立”姿勢(shì)形成和穩(wěn)定.

圖6 溶菌酶中Cα原子的RMSD和Rg隨模擬時(shí)間變化圖Fig.6 RMSD and the Rgvalues for Cαatoms of lysozyme as a function of simulation time

而在體系0.75Q中，蛋白質(zhì)的θ值主要維持在-50°上下波動(dòng)且波動(dòng)幅度很大.在17至20 ns期間，蛋白質(zhì)遠(yuǎn)離表面，其θ值發(fā)生明顯變化，在-120°至-60°區(qū)間內(nèi)波動(dòng)，即偶極平行于表面，蛋白質(zhì)呈現(xiàn)“平躺”姿勢(shì).蛋白質(zhì)的zcom值到1.6 ns時(shí)增大到5.7 nm，變化比體系1.3Q和體系Q中緩慢.其后，zcom值降低，到5 ns時(shí)再次上升，最終達(dá)到7.2 nm.因此，體系0.75Q中，模擬終點(diǎn)時(shí)zcom值小于體系1.3Q的情況，表明靜電排斥減弱，蛋白質(zhì)穩(wěn)定位置更靠近表面.但需要注意的是，雖然體系0.75Q中模擬終點(diǎn)的zcom值大于體系Q，但其概率分布(圖7C)表明，在zcom值較大區(qū)域蛋白質(zhì)的θ角偏離-60°到60°區(qū)域，表明蛋白質(zhì)此時(shí)并不存在“站立”姿勢(shì).而其主要分布區(qū)域是在zcom=5 nm處，此時(shí)其θ=-60°，表明體系0.75Q中，蛋白質(zhì)也形成“站立”取向，但趨勢(shì)更弱.

圖8顯示，在1.3Q和0.75Q兩體系中，蛋白質(zhì)和表面之間的LJ勢(shì)能都基本為0，與體系Q相同，表明在靜電排斥表面體系中，蛋白質(zhì)和表面間距離較遠(yuǎn)，而LJ勢(shì)能為短程相互作用，隨距離增大迅速衰減.而靜電相互作用很強(qiáng)，在兩體系中均呈現(xiàn)迅速下降，然后趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，分別穩(wěn)定在83和19 MJ·mol-1.勢(shì)能變化表明蛋白質(zhì)的位置和空間取向變化受靜電排斥作用調(diào)控，且受到表面所帶電荷數(shù)影響.表面電荷數(shù)增大，蛋白質(zhì)的平衡位置更遠(yuǎn)離表面，且利于“站立”姿勢(shì)的形成和維持.

圖9顯示，在1.3Q和0.75Q兩體系中，蛋白質(zhì)的RMSD值均隨模擬進(jìn)行而迅速上升，然后分別在0.70和0.15 nm上下波動(dòng).而兩體系中蛋白質(zhì)的Rg值略微不同，體系1.3Q中Rg值高于初始天然態(tài)，且存在顯著增大再回落的過(guò)程(如2.6 ns時(shí)).而體系0.75Q中Rg值基本保持在天然態(tài)的Rg值.結(jié)合RMSD和Rg值分析表明，隨著所帶電荷數(shù)增大，表面對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)擾動(dòng)加劇.反之，電荷數(shù)降低的表面對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)擾動(dòng)減弱，使蛋白質(zhì)能夠更好保持其天然結(jié)構(gòu).

圖7 介質(zhì)電荷數(shù)對(duì)溶菌酶的空間取向和位置的影響Fig.7 Effects of charge number of resin on the orientation and location of lysozyme

圖8 介質(zhì)電荷數(shù)對(duì)溶菌酶和介質(zhì)間相互作用勢(shì)能的影響Fig.8 Effects of charge number of resin on the interaction energies between the lysozyme and the resin

4 結(jié)論

圖9 介質(zhì)電荷數(shù)對(duì)溶菌酶構(gòu)象的影響Fig.9 Effects of charge number of resin on the conformation of lysozyme

以同電荷離子交換介質(zhì)促進(jìn)溶菌酶等蛋白質(zhì)復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為背景，通過(guò)靜電排斥表面模擬同電荷離子交換介質(zhì)，構(gòu)建溶菌酶在靜電排斥表面體系中的全原子模型，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬考察蛋白質(zhì)在表面上的空間取向和構(gòu)象變化，并通過(guò)相互作用勢(shì)能分析深入剖析靜電排斥表面的作用機(jī)理和細(xì)節(jié).結(jié)果表明，蛋白質(zhì)在表面的靜電排斥作用下迅速遠(yuǎn)離，在此過(guò)程中逐漸形成其偶極垂直于表面的“站立”姿勢(shì).此定向排布有助于增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的靜電排斥作用而抑制溶菌酶聚集.但是，由于蛋白質(zhì)中帶正電荷的殘基和帶負(fù)電荷的殘基受力方向相反，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)拉伸而破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu).研究發(fā)現(xiàn)表面所帶電荷數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的空間取向和構(gòu)象變化有顯著影響.電荷數(shù)增大使得表面對(duì)蛋白質(zhì)的靜電排斥作用增強(qiáng)，能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)更快更好地形成“站立”姿勢(shì).而表面所帶電荷數(shù)降低，則不利于蛋白質(zhì)維持“站立”姿勢(shì).同時(shí)，本文的模擬中尚有四個(gè)影響因素需要在后續(xù)研究中考慮.其一，模擬體系中的大量溶劑分子會(huì)影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象和空間取向調(diào)整.其二，本文研究的排斥性界面不同于吸附性界面.吸附性界面作用下，蛋白質(zhì)靠近界面使得相互作用增強(qiáng)，因而利于形成明顯的空間取向分布.而排斥性界面作用下，蛋白質(zhì)遠(yuǎn)離界面，使得相互作用減弱，不利于蛋白質(zhì)形成明顯空間取向，造成排斥性界面研究的困難.其三，限于計(jì)算量和模擬體系復(fù)雜度的考慮，本文僅模擬單個(gè)溶菌酶分子，能夠確證靜電排斥表面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成定向排布，但無(wú)法直接闡釋表面對(duì)蛋白質(zhì)分子間相互作用的影響，將在后續(xù)研究中開(kāi)展.其四，本文直接用晶體結(jié)構(gòu)建模計(jì)算，后續(xù)研究中可以先通過(guò)一定時(shí)間的模擬獲得溶菌酶在“自由”狀態(tài)下的構(gòu)象以消除溶液條件和力場(chǎng)的影響.總體而言，本文通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬完整闡釋蛋白質(zhì)在靜電排斥表面上的空間取向和構(gòu)象變化過(guò)程，考察此過(guò)程的微觀細(xì)節(jié)，并能確定表面電荷數(shù)等參數(shù)的影響規(guī)律，將有助于推動(dòng)蛋白質(zhì)在荷電表面折疊和分子相互作用研究.

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