王雪瑩，陸舍銘，朱麗，孟昭宇，曹秋娥

（1.紅塔煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南玉溪 653100；2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明 650091）

可可堿（3，7 一二甲基黃嘌呤）是黃嘌呤衍生物的一種，屬于嘌呤生物堿的化學(xué)物質(zhì)。醫(yī)藥上可可堿具有利尿、心肌興奮、血管舒張、平滑肌松弛等作用[1]?？煽芍破纷鳛槭称诽砑觿V泛存在于各種食品和飲料當(dāng)中，還可作為煙草香料改善煙草吸味[2]。近年來(lái)。人們?cè)絹?lái)越關(guān)注食品中的添加劑，而對(duì)于香精中的可可堿的檢測(cè)較少報(bào)道，因此，本試驗(yàn)對(duì)香精中的可可堿進(jìn)行檢測(cè)。

目前，檢測(cè)嘌呤類(lèi)生物堿的方法主要有薄層層析-紫外分光光度法[3-4]、液相色譜法[5-9]、氣相色譜[10-11]法、離子色譜法[12]等。由于超高效液相色譜法具有靈敏度高、精密度好、分析速度快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本文建立了一種測(cè)定香精中可可堿的超高效液相色譜法，該法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速，能滿足香精的實(shí)際檢驗(yàn)要求，適合批量香精樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純）：美國(guó)TEDIA公司；可可堿：中國(guó)藥品生物制品檢定所；水：試驗(yàn)用水均為二次石英蒸餾水，經(jīng)Millipore 超純水儀處理，電阻率≥18.2 MΩ·cm，使用前經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過(guò)濾；0.22 μm 水系濾膜：福建福州藍(lán)龍過(guò)濾器材有限公司；冰乙酸：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；20 種香精樣品：紅塔煙草集團(tuán)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLCTM 超高效液相色譜儀（Waters 公司），配備真空脫氣機(jī)、二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫柱箱、TUV 檢測(cè)器和色譜工作站；Millipore 超純水儀：美國(guó)Millipore 公司；PG503-S 電子分析天平（感量0.1 mg）：瑞士Mettler 公司；KQ700DB 型超聲清洗儀（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 色譜分析條件

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.50 g（精確0.000 1 g）香精樣品，置于50 mL 錐形瓶中，準(zhǔn)確加入10 mL 超純水，于室溫下超聲萃取40 min。將萃取液經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過(guò)濾后移入2 mL 樣品瓶，進(jìn)行超高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇和洗脫條件的優(yōu)化

試驗(yàn)中嘗試采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2%乙酸水溶液、乙腈-2%乙酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行分離分析。試驗(yàn)結(jié)果表明采用乙腈-水體系作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰有拖尾，峰形不對(duì)稱；采用甲醇-水體系結(jié)果的色譜峰尖銳，峰面積大，峰寬較窄。甲醇-2%乙酸作為流動(dòng)相時(shí)保留時(shí)間短，淋洗效果與甲醇-水相當(dāng)，故選擇甲醇-水作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。不同流動(dòng)相的色譜圖如圖1 所示。

圖1 不同流動(dòng)相洗脫時(shí)可可堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of theobromine standard solution in different mobile phase

試驗(yàn)中比較了不同梯度洗脫，分析結(jié)果表明：采用梯度洗脫可以使被測(cè)組分得到完全分離，梯度不變改變洗脫的流速發(fā)現(xiàn)，流速越大，保留時(shí)間越短，峰面積越小，峰高越低；流速越小，保留時(shí)間越長(zhǎng)，峰面積越大，峰寬越寬。梯度洗脫條件為：0 min～10.0 min，1%～5%甲醇；10.0 min～15.0 min，5%～30%甲醇；15.0 min～20.0 min，30%～70%甲醇；20.0 min～28.0 min，70%甲醇；28.0 min～29.0 min，70%～5%甲醇；29.0 min～30.0 min，5%甲醇；試驗(yàn)中優(yōu)化了淋洗液的流速，比較了流速為0.1、0.15、0.2、0.3 mL/min 的效果。結(jié)果表明，在0.10 mL/min的流速下，可可堿的色譜峰尖銳且對(duì)稱，如圖2 所示。

圖2 不同流速時(shí)可可堿標(biāo)準(zhǔn)樣品的UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of theobromine standard solution in different flow rate

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于可可堿的結(jié)構(gòu)特征使其在270 nm 波長(zhǎng)附近有紫外吸收。因此，為選擇適合可可堿的檢測(cè)波長(zhǎng)，分別在260、265、270、272、274、276、278、280、285、300 nm波長(zhǎng)下對(duì)樣品進(jìn)行掃描。分析結(jié)果顯示，在274 nm 波長(zhǎng)下可可堿的峰形尖銳（見(jiàn)圖4），有最大峰面積（見(jiàn)圖3），故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm。

圖3 可可堿標(biāo)準(zhǔn)溶液在10 個(gè)不同波長(zhǎng)下的峰面積比較圖Fig.3 Theobromine standard solution peak areas in ten different wavelength

圖4 可可堿標(biāo)準(zhǔn)品在4 個(gè)不同波長(zhǎng)下的UPLC 色譜圖Fig.4 UPLC chromatogram of tobromine standard solution in four different wavelength

2.2 萃取劑的選擇

準(zhǔn)確稱取一香精樣品0.50 g（精確至0.000 1 g），分別采用10 mL 的超純水、甲醇、乙腈、體積比為1 ∶1 的甲醇水溶液、乙腈水溶液對(duì)該樣品進(jìn)行超聲萃取，將萃取液分別經(jīng)0.22 μm 水系和有機(jī)系濾膜過(guò)濾后移入2 mL 樣品瓶，進(jìn)行超高效液相色譜分析。分析結(jié)果表明：超純水萃取后樣品的色譜峰面積最大（見(jiàn)表1），色譜峰的峰型尖銳且分離完全，因此選取超純水作為樣品分析的萃取劑。

表1 采用不同萃取劑時(shí)可可堿的峰面積Table 1 The peak area of theobromine in different extractant

2.3 萃取時(shí)間的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取一香精樣品0.50 g（精確至0.000 1 g），加入10 mL 超純水，分別超聲萃取20、30、40、50、60 min，將萃取液經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過(guò)濾后移入2 mL 樣品瓶，進(jìn)行超高效液相色譜分析。分析結(jié)果表明：隨著萃取時(shí)間的不斷增加，色譜峰面積先增后緩慢減小，超聲萃取40 min 時(shí)最色譜峰面積最大，結(jié)果如表2 所示，因此選擇萃取時(shí)間為40 min。

表2 采用不同萃取時(shí)間時(shí)可可堿的峰面積Table 2 The peak area of theobromine in different extraction time

2.4 工作曲線與檢測(cè)限

2.4.1 工作曲線的制作

準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確至0.000 1 g）可可堿標(biāo)準(zhǔn)品，使用超純水并定容至200 mL 容量瓶中，搖勻得到可可堿濃度為50.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為0.10、1.00、5.00、10.00、25.00 μg/mL 的5 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定結(jié)果，橫坐標(biāo)以保留時(shí)間（t）表示，單位為min；縱坐標(biāo)為峰面積以電導(dǎo)率（AU）表示，單位為μs（見(jiàn)圖5）。由測(cè)定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)液的濃度可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)（見(jiàn)表3）。

圖5 可可堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的UPLC 色譜圖Fig.5 UPLC chromatogram of theobromine standard solution

2.4.2 檢測(cè)限

移取標(biāo)準(zhǔn)溶液最低濃度0.10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL 于進(jìn)樣瓶中，平行測(cè)定11 次，檢測(cè)限根據(jù)公式CL=K sbl/S[13]計(jì)算出儀器檢測(cè)限。式中，CL－檢測(cè)限；sbl－測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)偏差；S－校正曲線的斜率；K=3；3sbl 對(duì)應(yīng)于90%的置信度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差并得到可可堿的檢測(cè)限（見(jiàn)表3）。

表3 可可堿的線性范圍、線性方程，相關(guān)系數(shù)和檢測(cè)限Table 3 Linear range，linear equation，correlation coefficent and limit of detection of theobromine

2.5 重現(xiàn)性及穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取5 號(hào)、19 號(hào)香精樣品0.50 g（精確至0.000 1 g），平行稱取6 份，分別加入10 mL 超純水，超聲萃取40 min，將萃取液經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過(guò)濾后移入2 mL 樣品瓶，在上述色譜分析條件下進(jìn)行超高效液相色譜分析，根據(jù)分析結(jié)果得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見(jiàn)表4，結(jié)果顯示：一日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6 次，兩種香精樣品中可可堿的RSD 分別為0.14%、0.89%，說(shuō)明該分析方法具有較好的重現(xiàn)性；三日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次的RSD 分別為0.22%、1.5%，說(shuō)明采用本文所述方法檢測(cè)可可堿時(shí)樣品在3 d 內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

表4 可可堿的精密度及穩(wěn)定性Table 4 The repeatability and repeatability of theobromine

2.6 回收率

在19 號(hào)香精樣品中分別加入高、中、低3 個(gè)不同量的可可堿標(biāo)準(zhǔn)樣品。準(zhǔn)確稱取添加標(biāo)樣后的19 號(hào)樣品0.50 g（精確至0.000 1 g），平行稱取3 份，以相同的條件進(jìn)行萃取和測(cè)定，通過(guò)未加標(biāo)測(cè)定值、加標(biāo)量和加標(biāo)后實(shí)際測(cè)定值計(jì)算其回收率（見(jiàn)表5）?？煽蓧A的回收率在91.86%～93.70%之間，說(shuō)明回收率較好。

表5 可可堿的回收率Table 5 The recovery of theobromine

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取20 種香精樣品0.50 g（精確至0.000 1 g）分別在上述萃取和色譜分析條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定兩份，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 20 種香精樣品中可可堿的測(cè)定結(jié)果Table 6 Theobromine determination result of twenty flavor samples

續(xù)表6 20 種香精樣品中可可堿的測(cè)定結(jié)果Continue table 6 Theobromine determination result of twenty flavor samples

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了測(cè)定香精中可可堿的超高效液相色譜法，并對(duì)20 種不同類(lèi)型的香精進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，可可堿標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰峰型尖銳且對(duì)稱；在0.16 mg/L～8.00 mg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.999 8）；被測(cè)定的20 種香精樣品中大部分不含有可可堿，5 種被測(cè)香精中含有可可堿，含量在34.46 μg/g～249.16 μg/g之間?？煽蓧A相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.14%～1.58%之間，平均回收率在91.86%～93.70%之間。說(shuō)明該方法簡(jiǎn)便快速，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

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