方細娟，曾慶祝，許慶陵，戰(zhàn)宇，劉鵬，林金鷹，顧采琴

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州 510006）

羅非魚是一種中小型魚，繁殖能力強，生長速度快，肉味鮮美，含有多種不飽和脂肪酸和豐富的蛋白質(zhì)，素有“白肉三文魚”之稱[1]。2010 年，我國羅非魚（tilapia）產(chǎn)量達120 萬t，占世界總產(chǎn)量的50%以上。羅非魚主要用于加工冷凍魚片出口歐美市場。由于羅非魚體形較扁，制造魚片的利用率只有整條魚的46%左右，而下腳料則高達54%以上，加工利用率不高，廢棄物較多[2]，導(dǎo)致加工企業(yè)利潤低，難以確保羅非魚產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展，所以探索新的加工方法具有重要現(xiàn)實意義。利用羅非魚制造水解蛋白具有原料利用率高、水解蛋白多肽及其相關(guān)產(chǎn)物具有特殊生物活性和重要應(yīng)用價值[3]。有關(guān)蛋白多肽的生物利用，Hara[4]較早就指出，蛋白質(zhì)在消化道中的消化終產(chǎn)物大部分是小肽而不是游離氨基酸（FAA），這些多肽具有與原蛋白相同的氨基酸組成成分，且這類小肽具有良好的溶解性和穩(wěn)定性。在此之后，開展了較多關(guān)于蛋白多肽制備及其生物活性等研究工作。目前，關(guān)于羅非魚肉蛋白的水解工藝研究的報道較少，這些研究主要是以水解度為指標，探討不同酶對羅非魚肉水解的影響，得出最佳水解酶及其最佳水解工藝條件，有的文獻還對水解產(chǎn)物的生理活性進行了研究[5-7]。而以水解度（DH）、三氯乙酸蛋白質(zhì)氮溶解指數(shù)（TCA-NSI）、酸溶肽得率（YASP）三個參數(shù)作為羅非魚蛋白水解工藝指標，并采用響應(yīng)面優(yōu)化手段探究其最佳工藝條件的研究尚未見報道。本文以DH、TCA-NSI、YASP 為指標探討了羅非魚蛋白水解的最佳工藝條件并得出回歸模型，為羅非魚深加工及高級蛋白產(chǎn)品的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚：購于市場，取其魚肉絞碎后冰箱冷凍保存，測其粗蛋白含量為18.31%、水分74.46%；Alcalase蛋白酶：天津諾維信生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白：上海緣聚生物科技有限公司。

1.2 主要設(shè)備

PL403 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV2300 紫外-可見分光光度計：上海天美可惜儀器有限公司；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PHS-25 數(shù)顯pH 計：上海精密科學儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市子華儀器有限責任公司；飛鴿牌離心機：上海安亭科學儀器廠；SZ-93 自動雙重純水蒸流器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酶活的測定用福林酚法[8]

酶活力的定義為：在40 ℃下每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1 mg/L 酪氨酸定為一個酶活力單位。

1.3.2 水解度的測定用甲醛滴定法[9]

1.3.3 三氯乙酸蛋白質(zhì)氮溶解指數(shù)的測定

先用10%的TCA 沉淀羅非魚魚肉蛋白水解液中的蛋白質(zhì)和大分子多肽，離心后取上清液，用甲醛滴定法測上清液中的游離氨基酸的含量[10]：

1.3.4 酸沉肽得率的測定用福林酚法[11]

1.4 酶解

稱取適量的自制魚靡加水混勻→55 ℃水浴預(yù)熱5 min →調(diào)pH →加入適量的酶→在適宜條件下水解→100 ℃水浴滅酶→冷卻→離心→抽濾分離→多肽水解液冰箱保存?zhèn)溆茫看螌嶒炞鋈M平行）。

2 結(jié)果與討論

2.1 各單因素對魚肉蛋白水解過程的影響

2.1.1 加酶量的影響

在液固比為3 ∶1、pH8.0、溫度為50 ℃、水解時間為1 h 的條件下，分別加925.5、1 851、3 702、5 553、7 404 U/g（以羅非魚計）的酶對魚肉蛋白進行水解，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 加酶量對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig 1 Effect of enzyme Quantity on DH，TCA-NSI and YASP

圖1 結(jié)果表明，DH、TCA-NSI 及YASP 均隨著加酶量的增加而逐漸升高，在液固比一定的情況下，隨著加酶量的增加，酶與底物接觸機會增多，酶對蛋白肽鍵的切割作用增大，DH、TCA-NSI 及YASP 均逐漸增加，如圖可知，DH 和TCA-NSI 增加幅度較大，而YASP 增加幅度較小，說明加酶量對溶液中產(chǎn)生游離氨基酸的影響很大而對溶液中產(chǎn)生多肽影響較少；當加酶量超過3 702U/g 時，隨著加酶量的增加，DH、TCA-NSI 及YASP 的增幅都趨于平緩。這是由于酶與底物的溶度已經(jīng)達到了飽和，底物被酶所飽和，底物可供酶所切割位點有限，再增加酶量，DH、TCA-NSI 及YASP 不會發(fā)生太大的變化。綜合加酶量對三個指標的影響，取3 702 U/g（以羅非魚計）為最適加酶量。

2.1.2 溫度的影響

在液固比為3 ∶1、pH8.0、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計）的條件下，分別在40、45、50、55、60 ℃下進行水解1 h，結(jié)果如圖2，可以看出，在溫度為40 ℃～55 ℃范圍內(nèi)，DH、TCA-NSI 和YASP 3 個指標都呈上升趨勢，當溫度超過55 ℃以后，DH、TCA-NSI 和YASP 反而呈下降趨勢，DH 值上升或下降幅度隨溫度的變化都不大，說明水解液中游離氨基酸的量基本保持不變。在酶解過程中，適當提高溫度可增強酶活力，從而促進魚肉蛋白的水解，但溫度太高則會使酶活力下降甚至有可能使酶失活，反而不利于水解。因此選擇55 ℃為適宜的水解溫度。

圖2 溫度對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.2 Effect of temperature on DH，TCA-NSI and YASP

2.1.3 pH 的影響

認識空間圖形，培養(yǎng)和發(fā)展學生的空間想像能力、推理論證能力、運用圖形語言進行交流的能力以及幾何直觀能力，是高中階段數(shù)學必修系列課程的基本要求.

選用不同的pH，在液固比為3 ∶1、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚計）的條件，水解1 h，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 pH 對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.3 The effect of pH on DH，TCA-NSI and YASP

圖3 結(jié)果顯示，pH 對DH、TCA-NSI、YASP 都有一定程度的影響，在pH 達到9 時，DH、TCA-NSI、YASP都達到了最大，然后pH 超過9 之后，DH、TCA-NSI 和YASP 均呈下降趨勢，由于pH 的升高，使酶的活性下降。從圖中也可以看出pH 對YASP 的影響比較大，這可能是因為pH 比較低時，溶液中的大分子比較多，而當pH 超過8.5 時，溶液中小分子肽和氨基酸的含量開始增加。因此，取最適pH 為9。

2.1.4 液固比的影響

選用不同的液固比，在pH9.0、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚計）的條件，水解1 h，結(jié)果如圖4所示，從圖4 可以看出，隨著酶與底物比的增加，DH、TCA-NSI、YASP 都有增加趨勢，而當酶與底物比超過一定值時，DH、TCA-NSI、YASP 都有所降低，原因在于特定的酶與底物濃度比有特定的結(jié)合方式，即不同的酶與底物濃度比將有不同的產(chǎn)物（分子量不同）。所以在較大的酶與底物比條件下的產(chǎn)物中，可能含有較多的較大分子量的分子。在測定TCA-NSI 和YASP 時，這些具有較大分子量的分子的部分或者全部就會沉淀下來，根據(jù)質(zhì)量守恒定律，留在溶液中的蛋白質(zhì)類（即多肽）就少了，所以TCA-NSI 和YASP 都降低了，且液固比過大的話，一方面雖然使底物分散更均勻，溶解度增加，但同時酶的溶度下降，勢必對蛋白水解產(chǎn)成不利影響。圖中液固比為1 ∶1～3 ∶1 時，DH、TCANSI、YASP 都呈上升趨勢，但超過3 ∶1 以后，都略微的有所下降，因此取3 ∶1 為適宜的液固比。

圖4 加水量與羅非魚肉之比對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.4 The effect of liquid-to-solid ratio on DH，TCA-NSI and YASP

2.1.5 酶解時間的影響

選用液固比為3 ∶1、pH9.0、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚計）的條件，分別水解不同時間，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 水解時間對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.5 The effect of reaction time on DH，TCA-NSI and YASP

從圖5 可以看出，隨著酶解時間的延長，DH、TCA-NSI、YASP 都增大，在反應(yīng)時間在1 h 之內(nèi)，DH、TAC-NSI、YASP 的增幅較大，當時間超過1 h 之后，DH 增幅趨于平穩(wěn)，TAC-NSI 不再增加，但YASP 反而有所下降，可能是由于水解越長，魚肉蛋白水解程度越大，產(chǎn)生的多肽被進一步水解，從而導(dǎo)致多肽減少，游離氨基酸的含量增加。從獲取較多多肽組分和節(jié)省能耗方面來考慮，選擇控制反應(yīng)的最佳時間為1 h。

2.2 酶解工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化

表1 相應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

根據(jù)以上實驗結(jié)果進行回歸擬合得到回歸方程如下。

DH 的回歸方程：

TCA-NSI 的回歸方程：

YASP 的回歸方程：

從表3 可以看出，3 個指標的回歸模型項都顯著，且失擬項不顯著，說明3 個回歸方程對試驗結(jié)果擬合得較好。從DH 模型的方差分析中可知，pH 和4 個條件的二次項顯著，說明溫度、pH、加酶量及液固比之間的交互作用對DH 無顯著影響；從TCA-NSI 模型的方差分析中可知，溫度的二次項極顯著以及交互相BC顯著，交互相BC 對TCA-NSI 的影響可從圖7 反映出；從YASP 模型的方差分析中可知，一次項C 影響顯著和二次項D2影響極顯著，交互性無顯著影響，說明溫度、pH、加酶量及液固比之間的交互作用對YASP無顯著影響。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表3 回歸模型的方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression model

上面響應(yīng)分析圖直觀反映了4 個因素以及交互作用對DH、TCA-NSI、YASP 3 個指標的影響程度。為了進一步優(yōu)化酶解的最佳工藝條件，通過Design expert 7.1.6 軟件綜合3 個指標的影響，對回歸方程進行偏微分，在試驗范圍內(nèi)，進行適當調(diào)整，得到最佳工藝條件為：溫度54.30 ℃，pH 為8.77，加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計），液固比為3.06：1，而在此條件下預(yù)測值DH為33.63%、TCA-NSI 為22.10%、YASP 為64.55%。從響應(yīng)面分析得出的最佳條件與單因素所得出的結(jié)果總體一致。

2.3 模型的驗證性試驗

為了驗證模型的準確性，根據(jù)所得的最佳工藝條件：溫度54.30 ℃，pH 為8.77，加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計），液固比為3.06 ∶1，水解時間1 h，進行驗證試驗，在此條件下進行了3 次平行試驗（如表4 所示），測出3 次DH 的平均值為33.57%、TCA-NSI 的平均值為22.09%、YASP 的平均值為64.52%，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，證明該模型合理可靠。

圖6 各因素對DH 影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagrams for four factors on DH

圖7 各因素對TCA-NSI 影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagrams for four factors on TCA-NSI

圖8 各因素對YASP 影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagrams for four factors on YASP

表4 驗證試驗Table 4 The test of validation

3 結(jié)論

1）單因素實驗結(jié)果可以看出，Alcalase 對羅非魚肉蛋白水解的適宜水解條件為：酶解時間1 h、液固比為3 ∶1、酶解pH 為9、酶解溫度為55 ℃、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計）。

2）用單因素所得的最佳條件進行了響應(yīng)面分析，對水解工藝條件做進一步優(yōu)化，得到了DH、TCA-NSI、YASP 的回歸方程模型，并通過微積分優(yōu)化得出羅非魚肉蛋白水解的最佳工藝條件：溫度54.30 ℃、pH 為8.77、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計）、液固比為3.06 ∶1、水解時間1 h，在此條件下預(yù)測值DH 為33.63%、TCANSI 為22.10%、YASP 為64.55%，實測值DH 為33.57%、TCA-NSI 為22.09%、YASP 為64.52%，預(yù)測值和實測值吻合較好，說明回歸模型能較好地預(yù)測DH、TCA-NSI、YASP 的實際指標。

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