呂運通，王文嶺，楊蓉婭，夏志寬，李海濤

阿薩希毛孢子菌( Trichosporon asahii, T. asahii)是毛孢子菌屬中常見的深部致病菌，在免疫功能低下的宿主可導致致命的系統(tǒng)感染，但目前對其生長發(fā)育特點、致病機制尚不十分清楚。1957 年，Girbardt[1]在光學顯微鏡下，觀察到位于菌絲頂端（hyphal tip）有一小的、易染色的球狀小體，這個球狀體被稱為頂體，與菌絲生長有著密切關系，頂體已經(jīng)在構巢曲霉[2,3]、煙曲霉[4,5]等多種真菌中被證實。T. asahii 在生長過程中可以出現(xiàn)孢子、芽胞、芽管、菌絲、關節(jié)菌絲等多種結構[6]，這些結構的形成與頂體有什么關系，我們對此進行了觀察，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

T. asahii（CBS 2479，購自荷蘭CBS 公司）由日本千葉大學醫(yī)學研究中心惠贈，-80℃保存。FM4-64 熒光染劑（美國Biotium 公司，激發(fā)波長為543 nm），二甲基亞砜（DSMO）（美國Sigma 公司），細胞松弛素D（以色列Fermentek 公司）。leica dm3000熒光數(shù)碼拍攝系統(tǒng)，濾光片LP560 (Ex543/Em560)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備和培養(yǎng)

取濃度為106/ml 的T. asahii 菌懸液2 ml 分別轉種于7 份30 ml 無菌YPD 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min 培養(yǎng)72 h。

1.2.2 T.asahii 頂體觀察 將FM4-64 溶解在DSMO中，終濃度為1.64 mmol/L。取0.5 ml 的菌懸液，加入2 μl 溶解好的FM4-64，孵育10 ～20 min，3 000 r/min 離心5 min，棄上清，加0.5 ml PBS 清洗2 次，3 000 r/min 離心5 min，取少量底層懸濁液涂片。在濾光片LP560（Ex543/Em560） 或LP505（Ex488/Em518）熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 不同濃度的細胞松弛素D 對T.asahii 的抑制 取濃度106/ml 的 2 ml T. asahii 菌液分別轉種于4 份30 ml 無菌YPD 培養(yǎng)基中，加入細胞松弛素D 分別致終濃度：0.5，1，2 μmol/L，不加細胞松弛素D 的為對照組。37 ℃，150 r/min 培養(yǎng)72 h。熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 T.asahii 頂體觀察

孢子和芽胞頂端有較明顯的熒光（圖1a，1b），部分芽管的兩端可見明顯的熒光（圖1c，1d），菌絲頂端可見熒光（圖1e，1f）。除了可觀察到菌絲明顯熒光，偶可見到假菌絲的一端有明顯的熒光（圖1g），部分假菌絲兩端同時出現(xiàn)熒光（圖1h），同時觀察到鏈珠狀孢子內(nèi)較彌散較明顯的熒光（圖1i）。

2.2 細胞松弛素D 對T.asahii 生長的影響

對照組菌絲生長良好，細長形，其頂端和近頂端可見明顯的熒光（圖2a，2b），經(jīng)不同濃度的細胞松弛素D 處理后的T.asahii，菌絲生長受到明顯的抑制，頂端熒光消失，熒光散在其體內(nèi)。

細胞松弛素D 的濃度為0.5 μmol/L 時，菌絲增粗，頂端及近頂端未見明顯的熒光（圖2c，2d）；1 μmol/L 時，菌絲進一步縮短，其體內(nèi)熒光點狀散在分布（圖2e，2f）；2 μmol/L 時，菌絲呈現(xiàn)芽管形態(tài)，其體內(nèi)熒光少量聚集或散在（圖2g，2h）。

3 討論

圖1 T.asahii 各種生長結構中的頂體（熒光顯微鏡×100）

圖2 細胞松弛素D對T.asahii生長影響（×100）

細胞極性的確立和維持，在真核生物的形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮著至關重要的作用。極性生長的模式在生物界中普遍存在，如絲狀真菌的菌絲、苔蘚及蕨的原絲體、植物的花粉管和根毛、動物的神經(jīng)細胞等。真菌的分生孢子萌發(fā)后，萌發(fā)管沿單一方向連續(xù)生長即頂端生長，以發(fā)育成為成熟的菌絲。在此過程中伴隨著細胞核的分裂，細胞質并不同步分裂。大多數(shù)真菌中，連續(xù)的幾次核分裂之后， 細胞質才發(fā)生一次分裂，在遠離菌絲頂端的一側形成隔，頂端細胞中的多個細胞核以非同步化的方式繼續(xù)分裂，在成熟的菌絲中一個細胞內(nèi)通常存在多個細胞核。絲狀真菌菌絲的生長，與其他植物極性細胞生長一樣，以細胞的頂端生長為特征，其生長僅限于菌絲頂端的穹窿區(qū)域，在直徑均勻的后部管狀區(qū)域則幾乎不再伸長。菌絲的頂端生長方式在一個世紀前已被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究對此進行了進一步闡述，指出菌絲的生長速率在頂端最大，距端l pm 處胞壁的合成速率可能是50 pm 處的50 倍，而在伸長區(qū)的基部，生長速率可能降為零。

Grove 等[7]利用冷凍置換電子顯微鏡證實了頂體是一種富含分泌囊泡的小體，Bartnicki- Garcia 等[8]提出囊泡供給中心模型（the vesicle supply center model，VSC），并且指出分泌囊泡在頂體集聚，然后被運送到細胞表面，與細胞膜融合并且釋放分泌囊泡里面的物質，計算機模型顯示在細胞表面的分泌囊泡呈現(xiàn)濃度梯度分布。

頂體的主要結構為分泌囊泡（secretory vesicles），頂體在功能上一般認為與微管組織中心(microtubule organizing center，MTOC) 有關。 在動物細胞中，MTOC 是中心體，中心體可隨細胞周期進行復制，并且在分裂期形成紡錘體的兩極；在真菌細胞中，MTOC 是紡錘體極體(spindle pole body，SPB)，MTOC 位于頂體之內(nèi)，已經(jīng)通過免疫定位技術在巨雌異水霉（Allomyces macrogynus）得到證實[9]。頂體內(nèi)聚集的分泌囊泡起著運送菌絲極性生長所需物質的作用，通過對真菌囊泡為基礎的數(shù)學模型的觀察，發(fā)現(xiàn)頂體就是一個涉及到細胞膜擴張的可移動囊泡的中心[10]。Reynaga-Pe?a 等[11]已經(jīng)通過實驗證實改變頂體的位置可以改變菌絲生長的方向，這就印證了Girbardt 所提出頂體可以控制菌絲生長方向的假說。

FM4-64 是兩性苯乙烯基熒光染料，這種染料有比較好的耐光性和較小的細胞毒性，通過細胞膜的內(nèi)吞作用透過細胞膜分布在分泌小泡膜的表面[12]。我們應用兩性苯乙烯基熒光染料FM4-64 對T. asahii進行了觀察研究，發(fā)現(xiàn)：①在芽胞、芽管、假菌絲、菌絲的近頂端都可以觀察到頂體這一結構表現(xiàn)出來的較強熒光。②假菌絲的兩端有時會同時出現(xiàn)較強的熒光，而在菌絲中這種現(xiàn)象是不存在的，可以推測假菌絲的生長也是受頂體所調控，這和其他真菌存在差異，從而提示T. asahii 的假菌絲尚有轉化生長為菌絲的可能。在串珠狀孢子的體內(nèi)熒光散在分布，提示此時的T. asahii 不具備或已經(jīng)喪失了極性生長的能力，或者正在孕育下一次的出芽。③加入細胞松弛素D 抑制頂體形成后，可以看到菌絲形成和生長受到顯著抑制。隨著細胞松弛素D 濃度的提高，菌絲形成的抑制越來越顯著，直至菌絲形成完全抑制，只能形成粗短的芽管，這一現(xiàn)象表明細胞松弛素D 能夠通過抑制分泌囊泡的轉運，從而抑制頂體的形成。

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