周建亮，符政遠，鄧 英，李勇忠

湖南省懷化市第一人民醫(yī)院感染科，湖南 懷化 418000

近年來HBeAg 陰性慢性乙型肝炎患者比例逐漸增多，HBeAg 陰性慢性乙型肝炎患者更易進展為肝炎后肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌，對抗病毒治療的持久應答率更低［1］。目前主張HBeAg 陰性慢性乙型肝炎長期抗病毒治療，但是尚不清楚抗病毒藥物是否直接抑制肝纖維化的形成。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的中間階段，近年研究發(fā)現肝纖維化及早期肝硬化可以逆轉，單純乙肝病毒DNA 轉陰的慢性肝病患者，仍然有部分進展到肝硬化，所以在抗病毒治療的同時需要抗肝纖維化治療。但是，臨床上缺乏有效的非創(chuàng)傷性檢測方法來評價HBeAg 陰性慢性乙型肝炎患者的肝纖維化程度，從而限制了抗肝纖維化藥物的研制及應用。已有的研究證實TGF-β1、TIMP-1、MMP-1 是肝纖維化形成中重要的細胞因子［2］，本研究觀察HBeAg 陰性CHB患者外周血TGF-β1、MMP-1、TIMP-1水平與肝組織活檢纖維化分級的關系，評價抗病毒治療對HBeAg 陰性慢性乙型肝炎患者外周血TGF-β1、MMP-1、TIMP-1 水平影響，探討抗病毒療效與血清TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的關系。以期為HBeAg 陰性慢性乙型肝炎抗病毒治療及肝纖維化的治療提供更多理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象及分組 我院2010年9月－2011年9月我院住院、門診的HBeAg 陰性慢性乙型肝炎患者65例，男45例，女20例，年齡18～65歲。HBeAg 陰性慢性乙型肝炎診斷符合慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)診斷標準［3］。HBeAg 陰性CHB 依據肝功能分為輕、中、重度組。門診正常體檢健康者血清30例設為對照組。對于有抗病毒治療指征的慢性乙型肝炎患者50例給予抗乙肝病毒治療，采用干擾素或核苷類藥物(拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋)，依據治療48周后DNA 低于檢測下限分為治療有效組和治療無效組。共22例進行了肝組織病理活檢，其中S0 期4例、S1期6例、S2 期7例、S3 期5例、S4 期0例。

1.2 血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1的測定 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定，所有受試者空腹10～12 h，晨起抽肘靜脈血3 ml，靜置后取上清液，標本放于－20℃保存統一待檢。人血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1 測定試劑盒購自美國RD 公司。操作步驟按試劑盒說明進行。

1.3 肝組織TIMP-1、MMP-1 檢測 采用免疫組化法檢測，免疫組化采用SP 法，所用試劑購自上海太陽生物技術有限公司。結果由兩位病理科醫(yī)師在光學顯微鏡和圖文報告系統下雙盲法閱片，MMP-1、TIMP-1染色陽性信號均呈黃色或黃棕色細顆粒狀，主要位于細胞質。陽性判斷的方法，隨機選擇10個高倍視野進行計數，根據染色程度和著色細胞百分率進行半定量積分法判斷結果，具體判斷如下:①陽性細胞≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分:②陽性強度:無色為0分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分。將①、②兩者積分相乘，0 分為染色陰性(－)，1～4 分為染色弱陽性(+)，5～8 分為染色陽性(++)，9～12 分為染色強陽性(+++)。

1.4 統計學方法 應用SPSS 13.0 數據統計軟件對血清學指標進行方差分析，肝臟病理學檢測數據用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1的水平及比較 HBeAg 陰性慢性乙型肝炎外周血TGF-β1、TIMP-1水平明顯高于正常對照組(P＜0.01)，而血清MMP-1 則明顯低于正常對照組(P＜0.01)。隨慢性肝炎輕度-重度逐漸發(fā)展，血清TGF-β1、TIMP-1的水平逐漸增高，且差異有統計學意義(P＜0.05);血清MMP-1 水平逐漸下降，差異也具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1的水平及比較(，ng/ml)Tab 1 The comparison of serum levels of TGF-β1，TIMP-1，MMP-1 (，ng/ml)

表1 各組血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1的水平及比較(，ng/ml)Tab 1 The comparison of serum levels of TGF-β1，TIMP-1，MMP-1 (，ng/ml)

2.2 肝組織TIMP-1、MMP-1 陽性表達與肝纖維化分級關系 TIMP-1、MMP-1 染色陽性物質呈黃色、棕黃色細顆粒狀或片狀，主要分布于肝細胞胞漿中，部分浸潤匯管區(qū)血管壁和膽管壁上皮細胞也可見陽性表達(見圖1)。由表2可知，TIMP-1 蛋白在肝纖維化組織的陽性表達，隨肝纖維化程度的加重而增強，呈正相關(rs=0.618，P=0.002);MMP-1 蛋白在肝纖維化組織的陽性表達與肝纖維化程度無相關性(rs=0.077，P=0.732)。

圖1 肝組織TIMP-1、MMP-1 蛋白免疫組化 A:陰性對照組;B:TIMP-1;C:MMP-1Fig 1 The immunohistochemistry of TIMP-1，MMP-1 protein in the liver tissue

表2 TIMP-1、MMP-1 蛋白的表達與肝纖維化分級的關系Tab 2 Relationship between expressions of TIMP-1，MMP-1 protein and liver fibrosis

2.3 抗病毒療效與血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1關系 抗病毒治療48周后有效組血清TGF-β1、TIMP-1的含量明顯下降(P＜0.01);MMP-1 水平上升(P＜0.01)。無效組血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1 水平變化不明顯(P＞0.05，見表3)。

3 討論

肝纖維化病理生理過程非常復雜，主要表現為膠原蛋白為主的細胞外基質(ECM)大量增生和異常沉積，引起肝纖維化發(fā)生。細胞因子在肝纖維化進展中扮演重要角色［4］。TGF-β1 是肝纖維化形成中的一種重要的細胞因子，肝損傷時星狀細胞、枯否氏細胞及其他細胞通過自分泌或旁分泌的方式產生大量的TGFβ1，炎癥或損傷過程中釋放的纖溶酶及其他蛋白酶可進一步增強其活性，通過自身調節(jié)機制，刺激上述細胞產生更多的TGF-β1，形成逐級放大效應，導致TGF-β1的大量生成和激活［5］。激活的TGF-β 通過與細胞膜上的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體結合發(fā)揮作用。已經證實TGFβ1可上調HSC 表達Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原［6］及纖維連接蛋白(FN)和層粘連蛋白(LN)，促進靜息HSC激活。TGFβ1 不僅促進ECM 產生，且抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)合成，從而抑制ECM 降解。研究發(fā)現，TGF-β1 亦可促進HSC 表達金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)［7］。我們的研究表明，HBeAg 陰性慢性乙型肝炎患者外周血TGF-β1 水平高于健康人群，隨著炎癥由輕到重發(fā)展，TGF-β1 水平亦逐漸上升。

表3 抗病毒治療前后血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1的水平變化(，ng/ml)Tab 3 The changes of serum TGF-β1，TIMP-1，MMP-1 levels before and after antiviral therapy (，ng/ml)

表3 抗病毒治療前后血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1的水平變化(，ng/ml)Tab 3 The changes of serum TGF-β1，TIMP-1，MMP-1 levels before and after antiviral therapy (，ng/ml)

注:與本組治療前比較，a(t=4.409，P＜0.001);b(t=6.634，P＜0.001);c(t=-9.758，P＜0.001)與本組治療前比較，* (t=－2.02，P=0.843);#(t=－4.17，P=0.683);＆(t=－0.047，P=0.963)。

肝纖維的形成是膠原合成與降解失衡的結果，如果基質的沉積占優(yōu)勢，則向纖維化方向發(fā)展;如果基質降解過程增強，則肝纖維化可逆轉、恢復。細胞外基質的降解過程涉及到一系列的蛋白酶類。其中基質金屬蛋白酶類(MMPs)及其特異性抑制物組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)在肝臟基質蛋白的降解過程中發(fā)揮十分重要的作用。MMPs 是肝內ECM 在生理和病理狀態(tài)下降解的主要酶類，目前研究發(fā)現MMPs 家族包括25個成員，能降解許多種類的膠原和非膠原基質蛋白。MMP-1主要降解Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅹ型膠原，而Ⅰ型膠原是肝纖維化時的主要細胞外基質成分［8］。TIMP 是一種能特異地抑制MMPs的糖蛋白，肝纖維化過程中基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)表達增加，抑制MMPs 活性，導致ECM降解不足。一般認為隨肝纖維化程度加重，HSC 活化并伴隨有TIMP-1 表達的升高，而MMP-1 表達及活性下降［9］。研究表明血清TGF-β1、TIMP mRNA 水平與肝組織炎癥、纖維化程度呈正相關，而MMP-1 與纖維化程度呈負相關［10］，外周血TIMP-1和TGF-β1可作為早期肝纖維化無創(chuàng)診斷的敏感指標，與肝組織活檢結果對照，血清TIMP-1 水平檢測肝纖維化的敏感性達100%，特異性達75%［2］，與我們的研究結果一致。MMP-1 在不同階段肝纖維化時表達的研究報道不一。Muraeaki等［11］發(fā)現血清MMP-1 水平與慢性肝炎組織學嚴重程度呈負相關，其活性隨慢性肝病的進展而下降，我們研究發(fā)現在HBeAg 陰性CHB患者中血清MMP-1 水平隨肝臟炎癥活動逐漸降低。而Watanabe等［12］研究發(fā)現，在四氯化碳導致的肝纖維化大鼠模型中，肝纖維化早期時MMP-1 基因表達升高，進展至肝硬化的則發(fā)生下降。在我們的試驗中，觀察到組織MMP-1 蛋白表達與纖維化分期無相關性。

肝纖維化的治療最根本的是去除病因，臨床研究顯示干擾素或核苷類似物抗病毒治療不僅可減輕肝臟炎癥壞死，而且肝組織病理學檢查可見纖維化甚至肝硬化有所減輕。我們的研究發(fā)現，抗病毒治療有效組血清TGF-β1、TIMP-1 明顯降低，MMP-1 上升，與Guido等［13］在27例慢性丙型肝炎抗病毒治療觀察到的情況一致。Trocme等［14］在干擾素聯合利巴韋林抗丙型肝炎的臨床研究中發(fā)現抗病毒治療組血清PIIINP、HA、TIMP-1 水平下降，MMP-1 水平升高，即使抗病毒治療無應答組上述血清學指標亦有改變，Lebensztejn等［15］對47例兒童乙型肝炎患者給予IFN-α 治療5個月，治療結束后12個月監(jiān)測發(fā)現血清TIMP-1、MMP-2、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原的水平顯著降低，MMP-9/TlMP-1 比值升高，無應答者肝組織炎癥未改善，但其肝纖維化程度顯著減輕，提示抗病毒治療可直接抑制肝纖維化的形成。在我們的觀察中，抗病毒治療無效組，血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1 無明顯變化，可能與我們應用的抗病毒藥物除了干擾素外，還包括核苷類似物，核苷類似物是否對血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1 有影響，有待進一步實驗研究來闡明。

綜上所述，聯合檢測TGF-β1、TIMP-1、MMP-1 是判斷慢性肝病患者有無纖維組織增生的敏感而可靠的指標，動態(tài)觀察上述指標的變化，對臨床判斷肝纖維化程度和活動度有著重要價值，同時也為臨床療效的判斷提供有效的實驗依據。

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