杜 娟，夏佳楠，沈 麗，王元元，王亞蘋，張德芹

酪氨酸酶(TYR)是皮膚黑色素生物合成的主要限速酶，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為銅結(jié)合糖蛋白。在皮膚黑色素生物合成過程中，酪氨酸羥化生成多巴，多巴氧化生成多巴醌，二羥基吲哚轉(zhuǎn)化生成吲哚醌，這些反應(yīng)步驟均需TYR參與，TYR活性與黑色素合成量呈正相關(guān)[1]，TYR活性改變可引起色素障礙性皮膚病如白癜風(fēng)。白癜風(fēng)好發(fā)于暴露部位而影響美觀，機(jī)體酪氨酸酶活性是影響白癜風(fēng)的主要因素。2005年版《中國(guó)藥典》記載，骨碎補(bǔ)、菟絲子外用消風(fēng)祛斑[2]。本實(shí)驗(yàn)采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測(cè)菟絲子、骨碎補(bǔ)提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響，為菟絲子、骨碎補(bǔ)外用治療白癜風(fēng)提供藥效學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 TD-10001電子天平（天津市天馬儀器廠）；Infinite M200微量多功能讀板機(jī)TECAN。

1.2 藥物及試劑 菟絲子藥材：購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地：內(nèi)蒙，批號(hào)201004-1，由天津中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室李天祥老師鑒定為旋花科植物菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.）的干燥成熟種子。骨碎補(bǔ)藥材：購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地：江西，批號(hào)201103-2。由天津中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室李天祥老師鑒定為水龍骨科植物槲蕨（Drynaria fortunei Kunze J.Sm.）的干燥根莖。Tyrosinase（批號(hào) #120M700，美國(guó)Sigma公司）；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110422-200610）；L-DOPA（批號(hào) #080M1712V，美國(guó) Sigma公司）；磷酸緩沖液（批號(hào)P1010，北京索萊寶科技有限公司）；甲氧沙林（1g/L，批號(hào)2010004，重慶華邦制藥股份有限公司產(chǎn)品）。

2 方法

2.1 試劑及藥物的配制 菟絲子提取物的制備[3]：菟絲子藥材粉碎過100目篩，稱取藥材粉末8g按照1∶14的比例置于112 mL 55%的乙醇中，60℃水浴振蕩提取2次，每次2 h，合并提取液，濃縮，藥渣溶于4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，配成2g/mL的藥液，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至 2、1、0.5、0.25g/mL 不同濃度。

骨碎補(bǔ)提取物的制備[4]：60%乙醇回流提取3次，濃縮烘干后保存?zhèn)溆?。配制：?shí)驗(yàn)時(shí)稱取骨碎補(bǔ)浸膏200 mg，溶于1 mL的二甲基砜（DMSO）中，配成200 mg/mL 的藥液，用 PBS稀釋至 100、50、25g/L 不同濃度。

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)110422-200610。配制：精密稱取柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，溶于0.2 mL的DMSO中，配成10g/L的溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)用PBS釋至400、200、100、50 μg/mL 不同濃度。

L-多巴溶液（10mmol/L）：稱取 197.19mg，用 PBS定容至 100 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配（MW：197.19g/mol）。

酪氨酸酶溶液（143 U）：稱取 13.28 mg（25 KU）蘑菇酪氨酸酶（1 881 U/mg），用PBS定容至25 mL，即1 KU/mL。分裝-20℃保存，臨用時(shí)室溫平衡，稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度143 U/mL。

2.2 酪氨酸酶活性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[5]方法。以蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法測(cè)定酪氨酸酶活性，反應(yīng)混合物（20 μL 的樣品+70 μL 143 U/mL 的蘑菇酪氨酸酶）37℃溫育 10 min，加入 70 μL 10 mmol/L的L-多巴溶液，2 min后立即于475 nm處測(cè)其吸光度，模型組以PBS代替樣品的反應(yīng)混合物作為模型對(duì)照組。每個(gè)樣品均設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組，以70μL PBS代替蘑菇酪氨酸酶。

菟絲子的提取物取 2、1、0.5、0.25g/mL 4 種不同濃度；骨碎補(bǔ)提取物取100、50、25g/L不同濃度；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品取 400、200、100、50 μg/mL 4 種不同濃度。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

按以下公式計(jì)算酶激活率[6]：酪氨酸酶激活率（%）=[（C－D）－（A－B）]/（A－B）×100。其中：A：未加樣品的加酶混合液所測(cè)的吸收度；B：未加樣品也未加酶的混合液所測(cè)的吸收度；C：加樣品和酶的混合液所測(cè)的吸光度；D：加中藥樣品而未加酶的混合液所測(cè)的吸光度。

2.3 統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

見表1、表2。

表1 菟絲子提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

表1 菟絲子提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

注：與甲氧沙林組相比，**P<0.01。

組別 濃度（g/mL） 激活率（%）甲氧沙林組 0.001 5.07±0.17菟絲子提取物 2.000 13.14±3.06**1.000 56.07±0.72**0.500 68.22±0.37**0.250 50.09±1.96**

由表1可見，菟絲子提取物的不同濃度對(duì)酪氨酸酶活性具有不同濃度的激活作用，且相比于陽(yáng)性藥甲氧沙林，各濃度菟絲子提取物對(duì)酪氨酸酶的激活率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明，菟絲子提取物具有激活酪氨酸酶活性的作用且優(yōu)于甲氧沙林。

由表2可見，骨碎補(bǔ)提取物和其主要成分柚皮苷均對(duì)酪氨酸酶活性具有激活作用，相比于陽(yáng)性藥甲氧沙林，濃度為200、100g/L骨碎補(bǔ)的提取物和濃度為400、200 μg/mL的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），結(jié)果表明，骨碎補(bǔ)提取物和柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品具有激活酪氨酸酶活性的作用且優(yōu)于甲氧沙林。

表2 骨碎補(bǔ)對(duì)蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

表2 骨碎補(bǔ)對(duì)蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

注：與甲氧沙林組相比，*P<0.05；**P<0.01。

組別 濃度（g/L） 激活率（%）甲氧沙林組 1.00 5.07±0.17骨碎補(bǔ)提取物 200.00 67.44±17.23**100.00 35.41±6.42**50.00 16.03±1.68 25.00 9.58±3.60柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品 0.40 28.63±0.83*0.20 20.83±2.74*0.10 7.88±1.80 0.05 7.07±1.08

4 討論

作為黑色素合成的關(guān)鍵酶，酪氨酸酶活性的異常可能導(dǎo)致皮膚色素生成的異常。白癜風(fēng)是由多種原因引起的色素代謝障礙性疾病，主要原因是由于皮膚黑色素合成減少，其臨床上以皮膚色素脫失斑為特征。由于酪氨酸酶是各種生物體內(nèi)黑色素形成的關(guān)鍵酶，所以能夠激活酪氨酸酶、增強(qiáng)其活性的藥物，可促進(jìn)黑色素的合成，有助于白癜風(fēng)病損區(qū)色素的恢復(fù)[7]。本實(shí)驗(yàn)選用的陽(yáng)性藥甲氧沙林的主要成分補(bǔ)骨脂素[8]，補(bǔ)骨脂素已被證實(shí)是酪氨酸酶的激活劑，長(zhǎng)期用作治療白癜風(fēng)的藥物[9]。本實(shí)驗(yàn)證明菟絲子、骨碎補(bǔ)提取物體外對(duì)蘑菇酪氨酸酶的激活作用明顯強(qiáng)于補(bǔ)骨脂素，提示菟絲子、骨碎補(bǔ)提取物中含有比補(bǔ)骨脂素更強(qiáng)的、作用機(jī)制不同的某些化學(xué)成分，在此基礎(chǔ)上發(fā)展的新制劑可望有助于白癜風(fēng)的治療。有關(guān)菟絲子、骨碎補(bǔ)等對(duì)黑色素生成影響以及治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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