張 銳，趙海南，瞿繼蘭，李 琳，李 楠，劉志東

在臨床上，黃芩苷對眼科疾病如角膜炎、結(jié)膜炎的治療作用已經(jīng)得到廣泛肯定，對眼科常見的病原菌也均有很強的抑菌殺菌作用。目前國內(nèi)已經(jīng)上市的黃芩苷眼用制劑主要為滴眼液，但是由于黃芩苷的理化性質(zhì)以及滴眼液本身存在的劑型缺點，黃芩苷滴入眼部后會大量流失，從而造成藥效的維持時間較短，生物利用度較低。另外，角膜是呈弧形的透明生物膜，對外源性異物具有屏障作用，由于其上皮滲透性較差，成為影響眼用制劑吸收的主要因素。所以，改善角膜透過性，增加藥物的跨膜吸收，提高藥物的生物利用度成為眼用制劑面臨的主要問題。目前解決的方法主要是應(yīng)用滲透促進劑，如聚乙二醇硬脂酸酯 15（SolutolHS 15，Sol），一種聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯，低毒非離子表面活性劑，已經(jīng)被應(yīng)用于經(jīng)皮和口服給藥系統(tǒng)。

本文的模型藥物為黃芩苷，考察了滲透促進劑Sol對黃芩苷角膜透過率的影響，并探討了其作用機制，從而明確Sol作為一種新型的滲透促進劑在眼部給藥系統(tǒng)的應(yīng)用前景。

1 儀器和試劑

改良Franz擴散池﹙上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司），TK-20A型透皮擴散試驗儀﹙上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司﹚，AX205電子天平（MettleToledo，瑞士），Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，美國），SPD-10Avp島津高效液相色譜儀（HPLC）（Shimadzu，日本），AT-130柱溫箱（大連中匯達科學(xué)儀器有限公司）。黃芩苷原料藥（天津中新藥業(yè)，含量>90%），黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所），聚乙二醇硬脂酸酯15（北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司），其他試劑均為分析純。

白色家兔，雌雄兼用，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由北京沙河通利實驗動物養(yǎng)殖場提供，合格證號：SLXK京2010-0004。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 實驗裝置 本實驗采用改良的Franz立式擴散池，它由兩個內(nèi)徑大小相同的供給池和接受池組成，供給池的容積為0.5mL，接受池的容積為4.5mL，內(nèi)半徑為0.4 cm，有效的擴散面積為0.50 cm2。

2.2 樣品溶液的配制

2.2.1 空白溶液的配制 精密稱取黃芩苷0.1g，充分溶解于100 mL的新鮮pH 6.5磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，得黃芩苷pH 6.5 PBS溶液，作為空白對照溶液。

2.2.2 0.2%～2.0%Sol溶液的配制 分別稱取適量Sol加入新配制的10 mL空白對照溶液中，得到所需的不同濃度的Sol黃芩苷pH 6.5 PBS溶液。

2.3 離體角膜透過實驗 將家兔耳緣靜脈注射空氣致死，在致死后的20 min內(nèi)，用眼科手術(shù)剪和鑷子小心分離出角膜，并除去虹膜、鞏膜、睫狀體等多余的眼部組織，然后將離體的新鮮角膜小心的放在已放入攪拌子的接受池和供給池的中間，確定角膜的上皮層面向供給池之后，固定角膜，最后在接受池中加入4.5 mL新鮮配制的pH 6.5 PBS溶液，在供給池中加入0.5 mL不同藥物濃度的Sol溶液，并將供給池用保鮮膜密封。

裝置置于透皮擴散實驗儀中，溫度控制在37℃。實驗開始之后，分別于 40、80、120、160、200、240 min從接受池中將溶液全部取出，同時分別補充同溫等體積的pH 6.5 PBS溶液4.5 mL，樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，取樣20 μL，作HPLC分析。

2.4 數(shù)據(jù)處理 單位面積累積透過量Q計算公式如下：

其中：Cn為t時間藥物的測定濃度；Ci為t時間前的測定濃度；V0為接受池中溶液體積；V為取樣體積。

表觀滲透系數(shù)（Papp，cm/s）計算公式如下：

其中：C0為供給池初始藥物濃度；A為有效透過面積；ΔQ/Δt可由累積透過量—時間曲線穩(wěn)態(tài)部分的斜率求得。

表觀滲透系數(shù)及穩(wěn)態(tài)流量均以單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。

穩(wěn)態(tài)流量Jss計算公式如下：

2.5 角膜水化值的測定 角膜水化值是體外評價物質(zhì)對角膜組織刺激性的重要指標，本實驗以水化值考察促滲劑Sol對兔眼角膜的損傷。角膜水化值（H）計算公式如下：

其中，mb為體外實驗后暴露于擴散介質(zhì)的角膜區(qū)域的角膜質(zhì)量；ma為60℃干燥16 h后再次稱質(zhì)量的角膜質(zhì)量。

2.6 樣品測定

2.6.1 色譜條件 參照文獻[1-2]，黃芩苷色譜條件為色譜柱：Diamond DIKMAODS-C18；流動相：甲醇∶水∶磷酸（60∶40∶0.05）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。

2.6.2 專屬性考察 分別取空白角膜溶出物及含藥角膜溶出物的pH 6.5 PBS各20μL，作高效液相色譜（HPLC）分析，記錄色譜圖。如圖1、圖2所示，空白角膜溶出物不干擾藥物的HPLC測定。

2.6.3 標準曲線的制備 精密配制濃度為0.021 1～0.7385μg/mL的黃芩苷pH6.5PBS溶液，進樣20μL，記錄峰面積。直線回歸方程：A=562 52×C－459.01，r2=0.999 9，線性范圍為 0.021 1～0.738 5 μg/mL，如圖 3所示，樣品質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。在此范圍內(nèi)配制高、中、低3個質(zhì)量濃度的黃芩苷pH 6.5 PBS 溶液 0.105 5、0.316 5、0.422 μg/mL，測得日內(nèi)精密度RSD分別為0.32%、0.12%、0.21%，日間精密度RSD分別為0.55%、0.15%、0.19%，說明儀器精密度良好。

圖3 PBS溶液中黃芩苷回歸直線

2.7 結(jié)果 本實驗以黃芩苷pH 6.5 PBS溶液為對照，分別考察了0.2%、0.4%、0.8%、1.0%和2.0%的Sol為促滲劑時黃芩苷的角膜透過性。黃芩苷離體角膜透過參數(shù)見表1、表2，角膜透過曲線圖見圖4，Sol對角膜水化值的影響見表3。

圖4 Sol對黃芩苷離體角膜透過率的影響

如圖4所示，黃芩苷的表觀滲透系數(shù)隨著Sol濃度的升高而逐漸升高，而達到最大值之后，又隨著Sol濃度的繼續(xù)升高而逐漸減小。Sol的濃度為0.4%、0.8%時，黃芩苷的表觀滲透系數(shù)分別增加了2.05倍、1.65倍，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

正常的角膜水化值為76%～80%，超過83%即可判定角膜受到一定程度的損傷[3]。據(jù)文獻報道[4]，Sol具有較高的生理耐受性，體積分數(shù)低于10%對兔眼角膜沒有刺激性。另劉睿等[5]實驗過程中0.1%～1.0%的Sol對角膜無刺激性，因此本實驗對此范圍的體積分數(shù)進行了主要考察。由表3可知，本實驗中含不同濃度Sol的黃芩苷溶液對角膜水化值沒有顯著影響，表明實驗過程中角膜上皮細胞和內(nèi)皮細胞沒有被損傷。

3 討論

本實驗選用pH 6.5 PBS溶液做為擴散介質(zhì)，主要因為黃芩苷為弱酸性化合物，因此其在堿性溶液中降解迅速，在偏酸性的溶液中穩(wěn)定性相對較好。GBR液是一種生理溶液，其能保存離體角膜達6 h，因此在體外角膜透過實驗中多采用此溶液，但因GBR液呈堿性，黃芩苷在此溶液中極不穩(wěn)定，因而最終舍棄。最終選擇與生理環(huán)境相近且穩(wěn)定性較好的pH 6.5 PBS溶液作為體外角膜透過的接收液。

劉睿等[5]實驗結(jié)果闡述了Sol增加角膜透過量的可能機制，由于Sol在角膜上皮細胞的磷脂雙層中形成膠束，然后將細胞中的磷脂消除，從而達到增加藥物角膜透過量的作用。另有研究表明[6-10]，Sol促進藥物在黏膜的吸收作用機制是使細胞膜上的磷脂雙分子層運動更加有序，增加了膜的通透性，從而利于藥物的吸收。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sol顯著增加了藥物的角膜透過，并且具有濃度依賴性，0.4%和0.8%的Sol使黃芩苷的表觀滲透系數(shù)分別增加了2.05倍和1.65倍，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且對角膜無刺激性。表明一定濃度的Sol可顯著提高黃芩苷的角膜透過率，且對角膜無刺激性，因此Sol作為一種新型的滲透促進劑在眼部給藥系統(tǒng)中可被廣泛應(yīng)用。

表1 不同濃度Sol對黃芩苷離體角膜累積透過量的影響（±s，n=3）

表1 不同濃度Sol對黃芩苷離體角膜累積透過量的影響（±s，n=3）

Sol濃度（%）線性關(guān)系 r2 40 min 80 min 120 min 160 min 200 min 240 min藥物的累積透過量（μg/cm2）0.0 0.176 1±0.077 6 0.518 0±0.049 2 1.054 1±0.055 5 1.842 0±0.148 6 2.756 2±0.117 9 3.763 3±0.178 6 Q=0.018 2 t-0.858 9 0.970 2 0.2 0.255 9±0.097 2 0.747 8±0.144 6 1.421 3±0.210 3 2.300 2±0.104 5 3.191 7±0.084 3 4.177 6±0.184 1 Q=0.019 9 t-0.766 2 0.987 5 0.4 0.209 9±0.028 0 1.042 3±0.230 2 2.269 4±0.404 0 3.812 8±0.568 0 5.480 7±0.672 7 7.616 5±0.941 0 Q=0.037 1 t-1.783 9 0.979 0 0.8 0.335 3±0.083 6 1.028 1±0.078 3 2.010 7±0.061 4 3.310 5±0.467 4 4.806 8±0.786 0 6.249 8±0.917 5 Q=0.030 1 t-1.263 9 0.983 5 1.0 0.130 7±0.053 1 0.501 3±0.063 5 1.271 6±0.129 8 2.151 2±0.187 7 3.097 4±0.151 2 4.173 3±0.223 8 Q=0.020 6 t-1.000 6 0.981 1 2.0 0.078 6±0.018 7 0.552 8±0.058 6 1.189 3±0.033 0 1.988 2±0.026 7 2.896 7±0.137 1 3.604 2±0.123 2 Q=0.018 2 t-0.827 6 0.990 8

表2 不同濃度Sol對黃芩苷離體角膜透過參數(shù)的影響（±s，n=3）%

表2 不同濃度Sol對黃芩苷離體角膜透過參數(shù)的影響（±s，n=3）%

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

測定項目 0 0.2 0.4 0.8 1.0 2.0 Papp×106（cm/s）10.03±0.7511.03±0.6720.57±2.42**16.60±3.08*11.37±0.4310.08±0.55 Jss×103[μg（s/cm2）]10.15±0.76 11.08±0.76 20.82±2.44** 16.80±3.11* 11.42±0.34 10.13±0.63

表3 Sol對角膜水化值的影響（±s，n=3）%

表3 Sol對角膜水化值的影響（±s，n=3）%

測定項目 0 0.2 0.4 0.8 1.0 2.0角膜水化值 77.77±1.65 76.06±0.34 82.62±0.84 78.23±2.76 79.29±1.94 81.70±1.32

[1]崔 佳，魯燕俠，仝青英.感咳清顆粒中黃芩苷的含量測定[J].中國中藥雜志，2003，28（5）：462-463.

[2]張欣華，劉志東，張伯禮，等.羥丙基-β-環(huán)糊精對黃芩苷角膜透過性研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，25（6），506-508.

[3]Saettone M F，Chetom P，Cerbai R，et al.Evaluation of ocular permeation enhancers：in vitor effects on corneal transport of four blockers，and in ivtro/in vivo toxic activity[J].Int J Pharm，1996，142（1）：103-113

[4]Jim Jiao.Polyoxyethylated nonionic surfactants and their applications in topical ocular drug delivery[J].Adv Drug Deliv Rev，2008，60：1663.

[5]劉 睿，劉志東，舒樂新，等.3種滲透促進劑對芒果苷離體角膜透過率的影響[J].中國中藥雜志，2010，35（23）：3131-3134.

[6]周 莊，林紹彬.Solutol HS15對黃豆苷元小腸吸收促進作用的研究[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，42（1）：50-51.

[7]張密霞，李 越，杜 嶸，等.黃芩苷對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞分化的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，26（4）：199-201.

[8]李 越，杜 嶸，張艷軍.高效液相色譜法測定人參皂苷Rg1與黃芩苷在細胞培養(yǎng)基中的含量變化[J].天津中醫(yī)藥，2006，23（2）：160-162.

[9]汪麗婭，張占軍，王 忠，等.黃芩苷對腦缺血大鼠的治療作用及對Capase-3的影響[J].天津中醫(yī)藥，2006，23（2）：143-146.

[10]趙 諍，宋西衛(wèi)，劉志東.不同促滲劑對黃芩離體鼠皮透過行為的影響[J].天津中醫(yī)藥，2009，25（5）：423-425.