田力，白雨軒，田宏

（喀喇沁旗醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

大鼠心室肌細(xì)胞的分離及其單通道鈣電流的記錄

田力，白雨軒，田宏

（喀喇沁旗醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

采用Langendorff灌流、Worthington膠原酶法分離大鼠心室肌細(xì)胞，應(yīng)用膜片鉗制技術(shù)單通道模式記錄大鼠心室肌細(xì)胞的鈣電流，并進(jìn)行膜片鉗電生理學(xué)研究.

心室肌細(xì)胞；膜片鉗；單通道；鈣電流記錄

細(xì)胞的電活動是生命活動的基礎(chǔ)，而這些電活動則是通過細(xì)胞膜離子通道而實(shí)現(xiàn)的[1]，離子通道的基本功能是通過維持離子的跨膜運(yùn)動，產(chǎn)生生物電現(xiàn)象而完成的.因此研究膜離子通道的通透機(jī)制及各種離子通透性的變化對闡明細(xì)胞生物電現(xiàn)象和其他生命現(xiàn)象的機(jī)制具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值[2].德國生理學(xué)家Neher和Sakmann（1976）[3]首次報(bào)道了在單個蛙骨骼纖維上，用他們獨(dú)創(chuàng)的膜片鉗制技術(shù)，記錄到單通道電流.后來經(jīng)過他們對該技術(shù)的改進(jìn)（Hamill等1981）[1]，該技術(shù)可應(yīng)用于各種細(xì)胞的離子流研究，他們的成就獲得了（1991年）生理學(xué)諾貝爾獎.

膜片鉗技術(shù)一直是研究離子通道的主要技術(shù)，它使得我們能夠在單個的細(xì)胞上觀察單個的離子通道電活動，對離子通道的認(rèn)識向前跨進(jìn)到了分子水平[4].目前，膜片鉗技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生理、生物、藥理學(xué)等生命研究領(lǐng)域，對其發(fā)展起到了重要的作用.心臟的電學(xué)活動一直被人們所關(guān)注，單個心肌細(xì)胞分離的成功，以及這一技術(shù)的推廣，為在單個心肌細(xì)胞上進(jìn)行研究提供了條件.因此本研究在以往方法的基礎(chǔ)上對大鼠心室肌細(xì)胞分離方法進(jìn)行摸索和完善，并記錄觀察了所獲細(xì)胞的鈣電流單通道記錄.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠，體重300～500g.

1.1.2 主要試劑

KOH，NaH2PO4，KHPO4，NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，NaOH，Glucose和Taurine均為國產(chǎn)市售分析純試劑，Glutamicacid和HEPES購自Amresco公司，EGTA購自日本DOJINDO公司，Protease購自sigma公司，Worthington膠原酶購自worthington biochemicalcorporation.

1.1.3 主要儀器

（2）造成系統(tǒng)電壓發(fā)生閃變。對于分布式電源而言，其啟停均會受到一系列因素（如用戶實(shí)際用電量等）的影響，即具有很高的不確定性，如此一來，也就加大了系統(tǒng)電壓閃變的幾率和影響。除此之外，當(dāng)分布式電源提供的輸出量發(fā)生瞬間突變時(shí)，也將會引發(fā)系統(tǒng)電壓閃變的問題。

Langendorff灌流裝置，恒溫水浴鍋，小動物呼吸機(jī)，量筒，燒杯.

1.1.4 單通道膜片鉗技術(shù)記錄鈣電流

1.1.4.1 儀器：倒置顯微鏡(Olympus)、Axopatch200B放大器(Axon公司)、數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon公司)、微電極拉制儀(Sutter公司)、pClamp10軟件等.

1.1.4.2 試劑:灌流液為基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)液(mM):Aspartic acid100,KOH100,KCl30,MgCl20.5,EGTA1,Ca-Cl20.5,HEPES-KOH10，pH7.4.電極內(nèi)液組成(mM)：BaCl250,tetrathylammoniumchloride70,EGTA0.5,BayK86440.003,Hepes-CsOHbuffer10, pH7.4.

1.2 方法

1.2.1 大鼠心室肌細(xì)胞的分離

大鼠心室肌細(xì)胞的分離：采用大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉110mg/Kg進(jìn)行麻醉，置仰臥位固定，實(shí)行氣管插管，末端接連小動物呼吸機(jī)，然后打開胸腔，使心臟和主動脈暴露于體外，再進(jìn)行主動脈插管，最后將游離的心臟置于Langendorff裝置進(jìn)行主動脈逆行灌流.先用含鈣臺式液灌流約3min，再用無鈣臺式液灌流約6min，然后再用膠原酶消化40min左右，最后用KB液沖洗殘酶約5min.整個灌流系統(tǒng)用恒溫水浴保持在37℃，所有液體均用純氧飽和后再進(jìn)行試驗(yàn).灌流完畢后，取下心臟，放入室溫的KB液中機(jī)械分離細(xì)胞，得到單個細(xì)胞懸液.經(jīng)105μm的鋼絲膜過濾后，置于含有蛋白酶的KB液中37℃水浴均勻震蕩4min.離心3次(1000r/min)去除殘留酶，最后置于4℃的KB液靜置1h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

取細(xì)胞懸液滴加入到顯微鏡灌流浴槽中，待細(xì)胞沉底后用IO液進(jìn)行灌流，采用膜片鉗細(xì)胞貼附和膜內(nèi)向外兩種記錄細(xì)胞膜L型鈣通道的單通道電流，保持電位-70mV去極至0mV引出電流，波寬200ms，刺激頻率0.5Hz，經(jīng)由膜片鉗放大器進(jìn)行記錄后，以3.3kHz的采集速度將數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī).用pClamp10.0軟件記錄數(shù)據(jù)并以pClamp分析軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果

2.1 大鼠心室肌細(xì)胞的分離

經(jīng)上述方法分離后，得到存活的單個心室肌細(xì)胞達(dá)40%～50%；高倍鏡下可見，存活細(xì)胞形態(tài)良好，呈桿狀或柱狀，具有清晰的橫紋肌.

圖1 分離的大鼠心室肌細(xì)胞

圖2 大鼠心室肌細(xì)胞鈣電流單通道記錄

圖3 鈣通道關(guān)閉時(shí)間分布普通直方圖：τc=78.94ms

3 討論

3.1 心肌細(xì)胞的分離是整個實(shí)驗(yàn)的重要基礎(chǔ)，膜片鉗實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞標(biāo)本具有呼吸活性、耐鈣、細(xì)胞膜完整、平滑、清潔度高的條件，以利于微電極與細(xì)胞膜進(jìn)行高阻封接.心肌細(xì)胞分離有四個重要的因素，分別是手術(shù)的把握、灌流液的溫度以及pH值、水質(zhì)、膠原酶的用量及時(shí)間等.

3.2 鈣通道普遍存在于機(jī)體的各種組織和細(xì)胞，其功能主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[8].細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子對組織和細(xì)胞的各種生理活動具有廣泛地調(diào)控作用，是及其重要的第二信使.鈣離子對細(xì)胞功能和生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用是通過鈣信號系統(tǒng)來完成的，該系統(tǒng)幾乎參與了肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、基因表達(dá)等所有的生理過程.

3.3 心肌細(xì)胞的單通道的研究工作，修正了早期對離子流閘門（激活與失活）活動的認(rèn)識，證實(shí)了一些以往只能從理論上進(jìn)行的推測.更為重要的是，在應(yīng)用這種技術(shù)后，不斷的發(fā)現(xiàn)了一些新的離子流和離子通道.

4 結(jié)論

4.1 采用Langendorff灌流，Worthington膠原酶法分離并得到了大鼠心室肌細(xì)胞,細(xì)胞存活形態(tài)良好.應(yīng)用膜片鉗制技術(shù)單通道模式記錄并得到了大鼠心室肌細(xì)胞的鈣電流.

4.2 本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，可作為Inside out等相關(guān)科研實(shí)驗(yàn)的前期工作.

4.3 心肌細(xì)胞鈣離子電流的變化在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用，其重要性已經(jīng)受到人們越來越多的重視，對鈣通道的生理功能、特性及其作用藥物的方面的研究也將在心血管系統(tǒng)疾病及其他系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用.

〔1〕HamillO,MartyA,NeherEetal.Improved patch-clamptechniquesforhigh-resolution currentrecordingfromcellsandcell-free membranepatches.PflugersArch,1981;391(1):85.

〔2〕WeidmannS.Themicroelectrodeandthe heart1950-1970.InKaoFF,KoizumK, VassaleM(eds).ResearchinPhysiology[M]. AuloCaggiPublisher,Bolognal.19713-25.

〔3〕NeherE,SakmannB.Singlechannelcurrents recordedfrommembraneofdenervatedfrog musclefibers.Nature,1976,260:799-802.

〔4〕趙衛(wèi)紅,吳宇澄,王笑云,等.耐鈣心肌細(xì)胞的分離及其L型鈣通道電流觀察[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,23(1):21-23.

〔5〕ZhangJ.SongJ.WuDM．Analysisofemergentisolationmethodforcardiacmyoeytesin patchclampstudies[J].ChinJlntegrMedCardio一CerebrovDis，2008，6(10)1238-9.

〔6〕HintzKK,NorbyFI,DuanJH,eta1.Comparisonofcardiacexcitationcontractioncouplinginimlatedventricularmyocytesbetween ratandmouse.CompBioehemandPhysiol, 2002,133(1):191.

〔7〕ShangLJ,ZangYM,WangSW.Isolation ofcalcium-tolerantsinglemyocardialcellsand itselectrophysiologicalproperties[J].FourthMil MedUniv,2000,21(2):247-9.

〔8〕YangXiangjun,HuiJie,JiangTingbo,Song Jianping,LiuZhihua.Characteristicsofsingle Ca2+channelkineticsinfelinehypertrophied ventricularmyocytesandJIANGWenping. ChineseMedicalJournal2002;115(4):502-508.

R96

A

1673-260X（2013）06-0105-02