趙智穎，譚志遠，朱紅惠

(1 華南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，廣東省植物分子育種重點實驗室，廣東 廣州510642;2 廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東華南微生物應用重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東 廣州510070)

粘細菌Myxobacteria 屬于變形桿菌門的變形菌門(Proteobacteria)δ 變形菌亞綱(Deltaproteobacteria)［1］，共8 個科，22 個屬，50 多個種［2-7］，是一類具有多細胞行為的革蘭陰性細菌，具有運動能力并可產(chǎn)生子實體和抗逆性粘孢子［8］.

粘細菌屬于原核生物，但卻具有復雜的多細胞行為和形態(tài)發(fā)生機制，并具有顯著的社會學特征［9］，是目前原核生物中已知的唯一具有多細胞行為特征的類群，被認為是最高等的原核生物.粘細菌的細胞群體行為不但體現(xiàn)在細胞間通過信號的傳遞和感應進行協(xié)同攝食和運動，而且集中體現(xiàn)在其子實體結(jié)構(gòu)的分化發(fā)育上［10］.在營養(yǎng)匱乏的條件下，粘細菌的營養(yǎng)細胞經(jīng)受協(xié)同形態(tài)建成［2］，聚集形成子實體結(jié)構(gòu).最終，60%～95%的細胞發(fā)生程序性自溶，存活的細胞有序排列，其中一部分形成沒有生殖能力的結(jié)構(gòu)細胞［10］，另一部分細胞在子實體形成末期分化成具抗逆性的粘孢子.粘孢子的形成標志著子實體的成熟和發(fā)育過程的結(jié)束［11-12］.

除了分子鑒定，目前粘細菌的分類鑒定主要依靠粘細菌的形態(tài)特征，主要包括子實體形態(tài)、菌落特征、營養(yǎng)細胞和粘孢子形態(tài).粘細菌的形態(tài)特征是其分類的一個重要標準，一是因為粘細菌研究起步比較晚，粘細菌生理特征的描述只限于個別種屬，大多為粘細菌的模式菌株Myxococcus xanthus［13］;另外，粘細菌形態(tài)的復雜性意味著其形態(tài)分類比其他細菌更為可靠［2］.粘細菌依靠其形態(tài)特質(zhì)可初步鑒定到屬，進一步的鑒定需結(jié)合分子鑒定手段.

本文通過體式顯微鏡(Stereomicroscope，SMC)、掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)和透射電鏡(Transmission electricity microscope，TEM)技術，對幾株粘細菌的子實體結(jié)構(gòu)、菌落形態(tài)、營養(yǎng)細胞和粘孢子形態(tài)進行了觀察和比較.其中，使用SEM 和TEM 比傳統(tǒng)的光學顯微鏡對粘細菌的營養(yǎng)細胞和粘孢子能進行更清晰的觀察和精確的測量.本研究旨在更直觀、更準確地觀察、比較多株粘細菌的形態(tài)特征，為粘細菌的分類鑒定提供了更為清晰的圖片材料，從而為粘細菌分類鑒定提供一定的依據(jù).

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 菌種資源 粘細菌菌株黃色粘球菌Myxoxoccus xanthus 42-lyheh-1、橙色粘球菌Myxoxoccus fulvus sp-lmz-1、葉柄粘球菌Myxoxoccus stipitatus 42-4-1、弱小珊瑚桿菌Corallococcus exiguus 42-3-1、珊瑚狀珊瑚桿菌Corallococcus coralloides 42-x1-4、大孢珊瑚球菌Corallococcus macropsporus sp-lmz-2、匣狀粘球菌Pyxidicoccus fallax 42-10-3、過渡原囊菌Archangium gephyra 42-10-1、孢囊桿菌Cystobacter minus 42-mts-2是從廣東藥用植物根系土壤中分離得到，現(xiàn)保藏于廣東省微生物菌種保藏中心.

1.1.2 主要試劑和儀器 氯化鈣、戊二醛、無水乙醇、鋨酸、叔丁醇等常規(guī)分析純試劑購自環(huán)凱公司;瓊脂粉、放線菌酮購于健陽生物公司;凍干機(ES-2030);濺射儀(E-1010);體式顯微鏡(Leica M165C);掃描電鏡(日立S-3000N);透射電鏡(日立H-7650).

1．2 方法

1.2.1 SMC 觀察 粘細菌培養(yǎng)7 d 后，將培養(yǎng)物放置于體式顯微鏡的置物臺上，對其菌落形態(tài)與子實體進行觀察并拍照.

1.2.2 SEM 觀察 對培養(yǎng)至有明顯子實體產(chǎn)生的粘細菌進行取樣，用解剖刀切取約為0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 的小塊，將其置于30 g/L 的戊二醛中固定(≥5 h)，然后用pH 7.0 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PBS)漂洗6 次，每次20 min;10 g/L 的鋨酸處理40～60 min;PBS 漂洗4 次，每次20 min;φ 為30%和50%乙醇各漂洗2 次，每次10 min;φ 為75%和90%乙醇各漂洗1 次，每次15 min;無水乙醇漂洗3 次，每次15 min;叔丁醇置換2 次，每次20 min;置于凍干機中冷凍干燥;將處理后的樣品在體式顯微鏡下觀察并貼臺;用濺射儀進行噴金;置于掃描電鏡下觀察并拍照［14］.

1.2.3 TEM 觀察 用接種環(huán)刮取培養(yǎng)了3～7 d 的適量菌體于無菌水中，制成樣品懸液;吸取樣品懸液滴到有膜的銅網(wǎng)上，2 min 后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體;滴加pH 7.0、30 g/L 的磷鎢酸于銅網(wǎng)，2 min 后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余染液;滴加純水于銅網(wǎng)，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸取多余水，樣品干后電鏡觀察并拍照［15-16］.

2 結(jié)果與分析

2．1 SMC 觀察

通過SMC 觀察，可見粘細菌子實體顏色鮮明，大多呈亮黃色、亮橙色、鵝黃色、粉色、棕色、甚至黑色，形態(tài)多樣、結(jié)構(gòu)復雜，不同種屬間子實體形態(tài)差異較大，其特征性子實體結(jié)構(gòu)可作為粘細菌分類的重要依據(jù)，各種屬自然環(huán)境下形成的子實體形態(tài)如圖1 所示.圖2 顯示了所觀察粘細菌在純培養(yǎng)狀態(tài)下形成的菌落和子實體形態(tài)，純培養(yǎng)后，部分粘細菌仍能產(chǎn)生特征性子實體，但相當一部分種屬會隨著傳代次數(shù)的增加，子實體顏色和形態(tài)發(fā)生改變、甚至出現(xiàn)退化和消失的現(xiàn)象.其中，粘球菌屬與孢囊桿菌屬的粘細菌基本能保持較好的子實體形成能力.表1 描述了所觀察的各種屬粘細菌的主要形態(tài)特征.

圖1 自然狀態(tài)下誘導的多株粘細菌子實體形態(tài)圖Fig.1 Morphological characteristics of fruiting body of some myxobacteria strains

圖2 多株純培養(yǎng)粘細菌菌落及其子實體形態(tài)圖Fig.2 Morphological characteristics of colony of some myxobacteria strains

表1 分離到粘細菌各種屬的主要形態(tài)特征Tab．1 Morphological characteristics of the isolated myxobacteria strains

2．2 SEM 觀察

用SEM 對多個種屬的粘細菌子實體進行了觀察，在適宜的條件下，大量的營養(yǎng)細胞發(fā)生聚集并停止生長，大部分細胞發(fā)生自溶，聚集的細胞發(fā)生群體的生態(tài)學發(fā)育和細胞分化，形成子實體，孢子囊內(nèi)的營養(yǎng)細胞經(jīng)形態(tài)轉(zhuǎn)變生成粘孢子.子實體由一層薄的黏膜包被，孢子囊單獨或成群出現(xiàn)，形態(tài)多樣，呈圓球形、橢圓形、卷曲狀、團狀或鏈狀(圖3).在未成熟的子實體中，可觀察到不同時期的形狀不同的營養(yǎng)細胞和粘孢子;待子實體發(fā)育成熟后，組成子實體孢子囊的為均一的粘孢子.

圖3 多株粘細菌子實體的掃描電鏡觀察Fig.3 Scanning electron microscope observation of fruiting body of some myxobacteria strains

2．3 TEM 觀察

通過TEM 觀察，發(fā)現(xiàn)所觀察種屬粘細菌的營養(yǎng)細胞均屬Ⅰ型:呈細長型，末端鈍圓或稍稍變細，呈雪茄狀或針狀，長度變化較大，直徑為0.5～0.8 μm，長度為3.0～16.7 μm(圖4).大部分菌體中不均勻的分布著白色泡狀物，隨著時間的增加，泡狀物逐漸變大，菌體呈現(xiàn)溶解狀態(tài)，此時大部分菌體開始自溶.粘孢子呈圓球形、橢圓形或短桿狀，有強烈的折光性，被一層薄的被膜包裹.圓球形或橢圓形的粘孢子，直徑為1.0～2.0 μm，短桿狀粘孢子大小為0.5～0.7 μm×1.1～2.0 μm(圖5).

圖4 多株粘細菌營養(yǎng)細胞的透射電鏡觀察Fig.4 Transmission electricity microscope observation of vegetative cells of some myxobacteria strains

圖5 多株粘細菌粘孢子的透射電鏡觀察Fig.5 Transmission electricity microscope observation of myxospore of some myxobacteria strains

3 討論與結(jié)論

以往對粘細菌營養(yǎng)細胞和粘孢子形態(tài)的觀察多采用普通光學顯微鏡.比起普通光學顯微鏡，TEM 能對粘細菌營養(yǎng)細胞和粘孢子的形態(tài)特征進行更精確的觀察.普通顯微鏡分辨率為0.1～0.2 μm，放大倍數(shù)為1 000 倍，由于分辨率和放大倍數(shù)的局限［17］，只能粗略的觀察粘細菌營養(yǎng)細胞和粘孢子的形狀，對粘細菌營養(yǎng)細胞和粘孢子的長度和大小，也只能做粗略的測量.而TEM 分辨率可達0.1～0.2 nm，放大倍數(shù)可達60～100 萬倍，能準確區(qū)分營養(yǎng)細胞的形狀為針形、船形或是雪茄形，末端是鈍圓或細長;能準確的測量營養(yǎng)細胞的長度和寬度;能觀察到營養(yǎng)細胞的自溶現(xiàn)象;能夠清晰辨別粘孢子是圓球形或是橢球形;能觀察到粘孢子外部的包膜結(jié)構(gòu).粘細菌營養(yǎng)細胞和粘孢子形態(tài)結(jié)合粘細菌的特征性子實體結(jié)構(gòu)可以將粘細菌鑒定到屬，但種與種之間的鑒定仍需要結(jié)合分子鑒定手段.

粘細菌子實體的特征性結(jié)構(gòu)是粘細菌分類的最重要的指標，一般用SMC 進行觀察，但SMC 放大倍數(shù)有限，僅能夠用于子實體外部形態(tài)和大小的觀察，而SEM 分辨率可達0.5～1.0 nm，放大倍數(shù)可達20～30 萬倍，不僅可以對其特征性結(jié)構(gòu)進行準確的描述，還可對子實體結(jié)構(gòu)進行精確的區(qū)分:不具有繁殖能力的結(jié)構(gòu)部分，如孢子囊壁、囊柄等;具有繁殖能力的孢子囊部分，其內(nèi)包含了成熟的粘孢子.另外，SEM 不僅能觀察粘細菌子實體的形態(tài)特征，還能觀察到子實體形成過程中營養(yǎng)細胞有序聚集、定向爬行運動和營養(yǎng)細胞的形態(tài)變化過程.

從土壤樣品中分離得到的粘細菌，常常會因培養(yǎng)時間過長或傳代次數(shù)太多而引起子實體的退化，甚至喪失形成子實體的能力.因而在分離得到粘細菌后，應及時對其子實體形態(tài)進行觀察，并選取傳代次數(shù)較少的粘細菌進行其子實體的掃描電鏡觀察，以免錯失觀察粘細菌各種屬特征性子實體的最佳時間.在培養(yǎng)粘細菌時，應選取適當?shù)沫傊|(zhì)量濃度，質(zhì)量濃度在15 g/L 為宜.培養(yǎng)基太軟，在掃描電鏡制樣時，會增加用手術刀切取樣品的難度;培養(yǎng)基太硬，粘細菌則難以生長，且培養(yǎng)基容易在培養(yǎng)過程中脫水，阻礙粘細菌的正常生長［18］.在透射電鏡的制樣過程中，若樣品懸液中雜質(zhì)太多，如大量的細胞碎片、培養(yǎng)基殘渣、糖類以及各類鹽類結(jié)晶的存在都會干擾染色反應和電鏡的觀察［19］;尤其是糖類在電子束的轟擊下，容易碳化而有礙于觀察;由于粘細菌胞外多糖豐富，因此需減少磷鎢酸處理的時間，避免樣品在觀察時顏色太黑，影響觀察結(jié)果［20］.

本試驗利用從廣東藥用植物根際土壤分離得到的多個種屬粘細菌，通過SMC、SEM 和TEM 3 種觀察技術，對其子實體結(jié)構(gòu)、菌落形態(tài)、營養(yǎng)細胞和粘孢子形態(tài)進行了觀察和比較，對多個種屬粘細菌的顯微形態(tài)特征進行了詳細的描述，為粘細菌分類鑒定提供了圖片材料和理論基礎.

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