覃揚(yáng)達(dá) 司勇鋒* 蘭桂萍 周向陽 杜海軍 周 玲 曾 毅

（1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧530021；2 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京102206）

鼻咽癌患者樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)的初步研究

覃揚(yáng)達(dá)1司勇鋒1* 蘭桂萍1周向陽1杜海軍2周 玲2曾 毅2

（1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧530021；2 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京102206）

目的 探討不同進(jìn)展階段鼻咽癌患者的樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)效果。為臨床免疫治療提供的成熟樹突狀細(xì)胞。方法本研究選取臨床不同分期鼻咽癌患者的外周血分離單核淋巴細(xì)胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過光學(xué)顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)效果。結(jié)果體外誘導(dǎo)獲得的樹突狀細(xì)胞具有典型的形態(tài)，其細(xì)胞表面表達(dá)CD83、CD86和CD-DR樹突狀細(xì)胞的標(biāo)識分子。結(jié)論不同進(jìn)展階段鼻咽癌患者外周血均可以體外誘導(dǎo)出樹突狀細(xì)胞。

鼻咽癌；樹突狀細(xì)胞；體外誘導(dǎo)

鼻咽癌（Nasoparyngeal carcinoma，NPC）是中國南方一些?。ㄗ灾螀^(qū)）的常見惡性腫瘤之一。中晚期鼻咽癌治療后常常復(fù)發(fā)或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對此臨床上尚無有效治療方案。樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是人體內(nèi)分布廣泛、功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞（Antigen presenting cells，APC），也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的APC[1-3]。以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療，可以提高鼻咽癌患者的特異性細(xì)胞免疫水平，在NPC的DC的免疫治療方面取得一些進(jìn)展[4-6]。皮內(nèi)免疫DCLMP2可以有效地提升NPC患者的LMP2特異性CTL水平[5]。提高的特異性CTL可能會清除放化療后殘余的NPC細(xì)胞，抑制潛在NPC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。本研究取不同進(jìn)展階段的NPC患者外周血，進(jìn)行體外樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察不同進(jìn)展階段鼻咽癌患者的樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)效果，初步對確定了NPC患者進(jìn)行DC免疫治療的適用人群。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有患者需經(jīng)過病理確診為不同進(jìn)展階段的NPC患者，年齡＜70歲，需放化療后3個月以上，預(yù)期生存時間＞3個月。肝、腎、骨髓功能正常。簽署知情同意書，自愿接受DC-LMP2免疫。

1.2 材料DC

接受免疫的NPC分離外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)獲得。人重組細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α購自Peprotech公司。CD83、CD86和CDDR抗體 購于BD公司。CellGro DC培養(yǎng)基購于上海微科生化試劑公司。

1.3 DC誘導(dǎo)與培養(yǎng)

外周血分離自體PBMC，以5×106/孔接種六孔板。置37℃ 5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁2h，輕輕搖晃，棄去懸浮細(xì)胞，再緩慢往細(xì)胞孔中加入3mL含細(xì)胞因子的CellGro DC培養(yǎng)基（rhGMCSF終濃度500U/mL，rhIL-4終濃度500U/mL）。置5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。培養(yǎng)至第3天，半量更換CellGro DC培養(yǎng)基。每天光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。第7天發(fā)現(xiàn)的不規(guī)則的，具有樹突狀形態(tài)的細(xì)胞為DC。

1.4 DC檢測

吹打培養(yǎng)7d的DC，收集懸浮DC（250g/min，離心10min）。再在含成熟因子的DC培養(yǎng)基中（含rhGM-CSF 500U/mL、rhIL-4 500 U/mL、TNF-α 400U/mol），繼續(xù)培養(yǎng)48h。第9天收集成熟的DCLMP2（250g/min， 離心10min）。以CD83、CD86和DC-DR抗體標(biāo)記后及染色，用流式細(xì)胞儀檢測DC表面特征性分子的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 病例特征

本臨床試驗(yàn)病例均來源于廣西自治區(qū)人民醫(yī)院2010年6月至2011年3月。共24名NPC患者自愿參加了本次試驗(yàn)，女13名，男11名，年齡22～61歲。其中Ⅰ期3名（男2名，女1名），Ⅱ期10名（男4名，女6名），Ⅲ期7名（男3名，女名），Ⅳ期4名（男2名，女2名）。見表1。

表1 DC表面特征性分子的表達(dá)

2.2 DC形態(tài)鑒定

在光學(xué)顯微鏡下，外周血分離的單核細(xì)胞經(jīng)過體外的誘導(dǎo)和培養(yǎng)，細(xì)胞開始聚集成團(tuán)，細(xì)胞體積增大，逐步由貼壁轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋顟B(tài)，表面開始形成褶皺，周圍伸出許多樹突狀，形成不規(guī)則分支呈網(wǎng)狀，如圖1。

3 討 論

圖1 誘導(dǎo)后成熟后DC形態(tài)（400倍）

樹突狀細(xì)胞是1973年美國洛克菲勒大學(xué)的Steinman和Cohn[7]教授首先從小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞分離獲得，由于其表面有許多突起而形成許多褶皺，象伸展的樹枝，故而命名為樹突狀細(xì)胞。DC細(xì)胞的功能主要是參與機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。作為專職的的抗原提呈細(xì)胞，其活動能力是巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的10～100倍，可激活初始型T細(xì)胞[4]。但DC在體內(nèi)數(shù)目極少，不足外周血單核細(xì)胞的1%，因而自然分離DC十分困難。目前用于治療和研究的樹突狀細(xì)胞，均為體外培養(yǎng)獲得。由于一些腫瘤患者體內(nèi)的DC又發(fā)生功能缺陷。那么是否所有的腫瘤患者的前體細(xì)胞都可以誘導(dǎo)出成熟的樹突狀細(xì)胞呢？因而我們以鼻咽癌為例，試圖從體外培養(yǎng)的角度探討不同進(jìn)展階段的NPC患者的外周血是否可以培養(yǎng)成熟的樹突狀細(xì)胞。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：在所選的鼻咽癌患者的外周血中均可以誘導(dǎo)培養(yǎng)出具有典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)。通過流式細(xì)胞儀檢測在其表面表達(dá)DC特征性的CD83、CD86和DC-DR分子。這為我們對NPC患者DC為基礎(chǔ)的免疫治療對象的篩選提供了依據(jù)。誠然，這僅僅是免疫治療中對NPC患者篩選的條件之一，除此之外我們還對患者的年齡、生存期、身體狀況、臨床治療的時間、本人意愿等進(jìn)行多方面的具備的條件研究后才能最終確定治療方案。臨床治療方案及結(jié)果另有文章詳細(xì)報(bào)導(dǎo)。

[1] Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9(2):271-296.

[2] Knight SC,Stagg AJ.Antigen-presenting cell types[J].Curr Opin Immunol,1993,5(3):374-382.

[3] Hart DN.Dendritic cells:Unique leukocyte populations which control the primary immune response[J].Blood,1997,90(9):3245-3287.

[4] Lin CL,Lo WF.Immunization with Epstein-Barr Virus peptidepulsed dendritic cells induces functional CD8+T-cell immunity and may lead to tumor regression[J].Cancer Res,2002,62(23):6952-6958.

[5] Zuo JM,Zhou L.Induction of cytotoxic T lymphocyte responses in vivo after immunotherapy with dendritic cells in patients[J].J.Microbiol Immunol,2006,4(1):41-48.

[6] Pan Y,Zhang J.In vitro anti-tumor immune response induced by dendritic cells transfected with EBV-LMP2 recombinant adenovirus [J].Biochem Biophys Res Commun,2006,347(3):551-557.

[7] Steinman RM,Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice I Morphology quantitation tissue distribution[J].J Exp Med,1973,137(5):1142-1162.

A Preliminary Study on the Induction of Dendritic Cells in Patients with Nasopharyngeal Carcinoma in Vitro

(QIN Yang-da1, SI Yong-feng1*, LAN Gui-ping1, ZHOU Xiang-yang1, DU Hai-jun2, ZHOU Ling2, ZENG Yi2

1 People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China；
2 National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing100052, China)

ObjectiveExplore the effects of dendritic cells (DCs) induced in vitro in different stages of patients with nasopharyngeal carcinoma and offer the mature dendritic cells for clinical immuno-therapy. Methods Peripheral blood mononuclear lymphocytes were isolated from different stages of patients with nasopharyngeal carcinoma and induced into DCs in vitro. The morphology and molecular characteristics of DCs were detected by microscope and flow cytometry respectively.ResultsDCs with typical morphology were displayed after induction in vitro. Molecular of CD83CD86and CD-DR was detected on the surface of DCs.ConclusionDCs could be induced in vitro from different stages of patients with nasopharyngeal carcinoma.

R739.6

B

1671-8194（2013）18-0003-02

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（編號：重2010038）