徐文財(cái)，劉 秋，秦愛建,，胡序明,，吳庚華，孫 蘋，錢琨,，邵紅霞,，金文杰,

（1.揚(yáng)州大學(xué)教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009）

馬立克氏病病毒（Marek's disease virus, MDV）是一種致腫瘤性皰疹病毒，能夠引起皮膚和內(nèi)臟腫瘤，侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致易感雞的癱瘓或死亡[1,2]。UL14蛋白是MDV編碼的一種被膜蛋白，而被膜是MDV病毒粒子的重要組成部分。在1型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus 1，HSV1)中，UL14不僅具有抗凋亡作用[3]，還具有熱休克蛋白（Host shock protein，HSP）功能并可以調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制[4,5]。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，MDV UL14蛋白與HSV UL14蛋白同源，推測MDV的UL14也可能在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)化中扮演著關(guān)鍵角色。通過基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)感染RB1B 毒株21 d后的SPF雞胸腺組織中，UL14高水平表達(dá)[6]，這種表達(dá)的意義和作用是什么還不清楚。目前在MDV感染中還沒有UL14功能的相關(guān)報(bào)道。為了弄清UL14在MDV感染中所起的作用，特別是UL14對MDV致瘤性是否有影響，本研究對UL14進(jìn)行原核表達(dá)并制備特異性多抗，為以后UL14功能研究提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 病毒 菌株與細(xì)胞RB1B超強(qiáng)毒株、E.coliDH5α、BL21（DE3）工程菌由揚(yáng)州大學(xué)教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，CEF細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法制備。

1.2 載體與主要試劑原核表達(dá)載體pGET32a購自Clontech公司；pGEM-T easy載體、T4連接酶購于美國Promega公司；凝膠回收DNA試劑盒購于德國AXYGEN公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、XhoI購自Fermentas公司；堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IPTG、胰蛋白酶均購自Sigma公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)RB1B株UL14基因序列（GI：148806278）設(shè)計(jì)引物。為了便于目的基因的克隆，在上游引物中加入EcoR I 酶切位點(diǎn)，下游引物中加入XhoI 酶切位點(diǎn)。上游引物序列為5'-CCGAATTCATGTTTGCAGTGAGCGC-3'，下游引物為5'-TTCTCGAGTCATACACAGCTGTCTGA GA-3'，劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)。

1.4 UL14基因的擴(kuò)增與克隆參照文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法，從感染RB1B的CEF細(xì)胞中提取病毒DNA基因組。UL14基因的 PCR 擴(kuò)增條件:95℃ 5 min；94℃ 1 min ，55℃ 1 min，72℃ 2 min，30 個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連入pGEM-T載體，并送上海英駿生物技術(shù)公司（Invitrogen）測序。

1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建將測序正確的pGEM-T-UL14重組質(zhì)粒與 pET32a質(zhì)粒 DNA 經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳，回收相應(yīng)的UL14片段與pET32a空載體片段，然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，次日挑取單菌落制備質(zhì)粒DNA，然后再利用EcoR I和XhoI雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳篩選正確插入目的基因的重組質(zhì)粒。

1.6 UL14蛋白的原核表達(dá)將含有pET32a-UL14重組質(zhì)粒的細(xì)菌接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 rpm 震蕩培養(yǎng) 12 h，然后以 1：100 轉(zhuǎn)接種到含有氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，再加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，28℃ 180 rpm 震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)5 h，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌作為對照。取出培養(yǎng)物，超聲波裂解后，經(jīng)12%SDSPAGE電泳分析鑒定，并用His親和層析柱純化。

1.7 鼠抗融合蛋白UL14多抗血清的制備將4只BALB/c小鼠分別腹腔注射純化的融合蛋白，免疫劑量為每只100 μg蛋白，首次免疫后，每隔2 w以相同的方法和劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。小鼠4免10 d后分別采血分離血清。

1.8 Western blot鑒定參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法。轉(zhuǎn)印后用5%脫脂乳4℃封閉過夜。分別用抗UL14小鼠多抗血清和His單抗稀釋后作為一抗，37℃作用1 h。然后用AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，37℃作用1 h。用NBT避光顯色20 min，最后用ddH2O終止反應(yīng)。

1.9 IFA鑒定鼠抗融合蛋白UL14多抗血清的反應(yīng)性用96孔細(xì)胞板培養(yǎng)RB1B感染的CEF細(xì)胞，約5～6 d后進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。分別用抗UL14小鼠多抗血清和ICR小鼠血清作為一抗，37℃作用1 h。然后用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，37℃作用1 h。最后每孔加50%甘油100 uL，并在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pGEM-T-UL14與pET32a-UL14的鑒定PCR擴(kuò)增目的基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出條帶大小為732 bp的片段。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后，挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用EcoR I和XhoI雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果獲得了載體（2900 bp）和目的基因（732 bp）兩個片段，與預(yù)期結(jié)果相符。將膠回收的UL14基因片段與pET32a空載體片段轉(zhuǎn)化后得到pET32a-UL14重組質(zhì)粒，并用EcoR I和XhoI雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳后結(jié)果可見清晰的750 bp左右和5900 bp左右兩條帶，即獲得了正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，且目的基因測序結(jié)果正確。

2.2 His-UL14融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析將重組質(zhì)粒pET32a-UL14轉(zhuǎn)化的BL21（DE3)大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，菌體裂解物上清在分子量55 kDa處出現(xiàn)高表達(dá)條帶，與His-UL14融合蛋白分子量一致（圖1A)，而未誘導(dǎo)組無此條帶（圖1B）。用His親和層析柱純化表達(dá)的融合蛋白，然后分別用抗His標(biāo)簽的單抗和抗UL14多抗血清進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，抗His標(biāo)簽單抗能特異性地識別出55 kDa的蛋白條帶（圖2A），并且多抗血清也能特異性地識別出55 kDa的蛋白條帶（圖2B）。

圖1 UL14蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE graph of recombinant UL14

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析Fig.2 Recombinant UL14 protein identifi ed by Western blot

2.3 免疫熒光分析用 RB1B 感染 CEF 細(xì)胞 5～6 d，然后以抗UL14多抗血清作1：200稀釋后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果在感染MDV的細(xì)胞中出現(xiàn)特異性熒光（圖3A），而對照正常細(xì)胞則沒有出現(xiàn)特異性熒光（圖3B），結(jié)果證實(shí)用此融合蛋白免疫BALB/c小鼠后獲得的多抗血清能與MDV RB1B感染的CEF細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖3 RB1B感染CEF細(xì)胞后的免疫熒光分析Fig.3 Immunofl uorescence analysis of CEF cells infected with MDV strain RBIB

3 討論

UL14蛋白在人單純皰疹病毒方面研究較多，而在MDV方面則沒有相關(guān)報(bào)道。本研究對MDV UL14蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，并成功制備了抗UL14多抗血清，該抗血清與MDV天然的UL14有良好反應(yīng)性，研究結(jié)果對進(jìn)一步研究MDV致病機(jī)理提供了可靠的生物材料。

被膜蛋白是MDV病毒粒子的重要組成。通過對被膜蛋白功能及其相互作用關(guān)系的了解，可以使我們更好地了解MDV裝配途徑，并為尋找新的抗病毒靶序列標(biāo)提供了思路[9]。UL14蛋白是皰疹病毒編碼的一種被膜蛋白。MDV UL14蛋白與HSV UL14蛋白同源。HSV UL14蛋白能夠集中衣殼蛋白VP26和組裝蛋白UL33進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)[10]。在感染細(xì)胞中，尤其在感染的后期，UL14蛋白對HSV的復(fù)制起到非常重要的作用[4]，因此，MDV UL14蛋白在MDV致病過程中也可能扮演著重要作用。通過Real-Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在MDV感染后d 7、d 14、d 21、d 28 胸腺組織中，Meq 與 UL14 的表達(dá)趨勢是一致的[6]，二者之間是否存在相互作用協(xié)同致腫瘤有待進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

[1]Davison F, Nair V.Use of Marek's disease vaccines：could they be driving the virus to increasing virulence?[J].Expert Rev Vaccines, 2005, 4(1)： 77-88.

[2]Osterrieder N, Kamil J P, Schumacher D,et al.Marek's disease virus： from miasma to model[J].Nat Rev Microbiol, 2006, 4(4)： 283-294.

[3]Yamauchi Y, Daikoku T, Goshima F,et al.Herpes simplex virus UL14 protein blocks apoptosis[J].Microbiol Immunol, 2003, 47(9)： 685-689.

[4]Yamauchi Y, Kiriyama K, Kubota N,et al.The UL14 tegument protein of herpes simplex virus type 1 is required for efficient nuclear transport of the alpha transinducing factor VP16 and viral capsids[J].J Virol,2008, 82(3)： 1094-1106.

[5]Yamauchi Y, Wada K, Goshima F,et al.Herpes simplex virus type 2 UL14 gene product has heat shock protein(HSP)-like functions[J].J Cell Sci, 2002, 115(Pt 12)：2517-2527.

[6]Hu X, Qin A, Miao J,et al.Transcriptional profile of Marek's disease virus genes in chicken thymus during different phases of MDV infection[J].Arch Virol, 2013.

[7]張晨飛, 秦愛建, 鄧緒方, 等.馬立克氏病病毒Ⅰ型CVI988/Rispens疫苗株UL13激酶結(jié)構(gòu)域分析及其偏嗜密碼子片段在大腸桿菌中的表達(dá)[J].微生物學(xué)報(bào), 2009,(2)： 161-167.

[8]秦愛建, 崔治中.應(yīng)用親和層析法提純雞馬立克氏病病毒pp38基因重組產(chǎn)物[J].生物工程學(xué)報(bào), 1994(3)： 239-243.

[9]Vittone V, Diefenbach E, Triffett D,et al.Determination of interactions between tegument proteins of herpes simplex virus type 1[J].J Virol, 2005, 79(15)： 9566-9571.

[10]Yamauchi Y, Wada K, Goshima F,et al.The UL14 protein of herpes simplex virus type 2 translocates the minor capsid protein VP26 and the DNA cleavage and packaging UL33 protein into the nucleus of coexpressing cells[J].J Gen Virol, 2001, 82(Pt 2)： 321-330.