王 輝，李井新，孫 振，謝之景，姜運(yùn)良，成子強(qiáng)，周恩民，姜世金

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，泰安271018；2.山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安271018；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Procine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬成員，為單股正鏈RNA 病毒，主要引起母豬的繁殖障礙，如流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和呼吸道癥狀等，稱(chēng)為豬繁殖與呼吸綜合征（procine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）[1]。PRRSV主要分為歐洲型和美洲型，1996年在國(guó)內(nèi)首次分離到PRRSV，目前在我國(guó)流行的PRRSV 主要為美洲型[2]。2006年，無(wú)名高熱病在我國(guó)南方流行，最終確定為PRRSV高致病性nsp2變異株[3]。目前, 常用的診斷方法有RTPCR、間接免疫熒光試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光定量RT-PCR等[4-15]。

萊蕪豬是我國(guó)華北型地方豬種黃淮海黑豬的一個(gè)類(lèi)群，具有繁殖率高、哺育力強(qiáng)、耐粗料、抗病性強(qiáng)、雜交優(yōu)勢(shì)明顯、肉質(zhì)細(xì)嫩香醇等特性，近年來(lái)作為優(yōu)良地方品種豬得到了大規(guī)模養(yǎng)殖。本試驗(yàn)是將PRRSV接種到萊蕪黑豬健康仔豬體內(nèi)，利用TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法以檢測(cè)PRRSV在體內(nèi)的分布及增殖規(guī)律變化，為進(jìn)一步研究該病毒的致病機(jī)理，科學(xué)防控該病在萊蕪黑豬中的感染提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高致病性PRRSV JXl43變異株由山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；40日齡健康仔豬購(gòu)自萊蕪黑豬保種基地豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑High Pure RNA Tissue Kit、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 和 FastStart TaqMan Probe Master購(gòu)自Roche公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 引物和探針的合成按GeneBank中發(fā)表的參考序列，在保守區(qū)分別設(shè)計(jì)引物和探針，由上海金斯瑞生物科技有限公司合成。PRRSV-F:5'-CGGCAAAT ATAACCACGC-3'，PRRSV-R:5'-TTCTGCCACCCAACACGAG-3'；另外，針對(duì)ORF7基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)制備標(biāo)準(zhǔn)品的引物:PF:5'-CCTTCGGGTACATGACATTCGT-3'；PR:5'-TTGCTGCTTGCCGTTGTTATT-3'；探針PRRSV-P序列為:5'-FAM-TGCCGTTGACC GTAGTGGAGCC-TAMRA-3'。

1.4 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備用常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增PRRSVORF7基因，用DNA回收試劑盒回收目的片段，然后連接到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化DHl0α感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定后，由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。提取質(zhì)粒的大約濃度為7×1010copies/μL。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化用矩陣法對(duì)熒光定量PCR 的循環(huán)參數(shù)、引物和探針濃度以及所選引物與探針的組合等進(jìn)行篩選優(yōu)化，以得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制以10倍稀釋已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒為模板，經(jīng)熒光定量PCR儀檢測(cè)，得到動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，并計(jì)算出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.7 靈敏性試驗(yàn)將已計(jì)算出拷貝數(shù)的含目的基因的質(zhì)粒做10倍梯度稀釋?zhuān)♂屩劣脽晒舛縋CR儀不能檢出，以此計(jì)算出熒光定量PCR所能檢出的最低模板拷貝數(shù)。

1.8 特異性試驗(yàn)以豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、日本乙型腦炎（Japanese encephalitis virus，JEV）、圓環(huán)病毒 2 型（Porcine circovirus ，PCV2）和PRRSV JXl43株的核酸為模板，應(yīng)用優(yōu)化的熒光定量PCR條件進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)以 RNA 標(biāo)準(zhǔn)品（103～107拷貝 /μL）為模板，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。

1.10 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及感染試驗(yàn)40日齡健康萊蕪黑豬仔豬15頭，經(jīng)RT-PCR和ELISA檢測(cè)為PRRSV陰性。隨機(jī)分為2組，攻毒組10頭，對(duì)照組5頭，分別人工鼻腔接種5 mL/頭PRRSV液和PBS。于攻毒后第3、7、14、21、28 d各剖殺攻毒組豬2頭，對(duì)照組豬1頭，分離心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、扁桃體、頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)等組織備用。

1.11 臨床癥狀觀(guān)察及剖檢變化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每日觀(guān)察實(shí)驗(yàn)豬的臨床癥狀，并作好記錄。每日定時(shí)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的直腸體溫、觀(guān)察精神狀況、食欲等。剖殺時(shí)，對(duì)比觀(guān)察肺臟、肝臟、腎臟和主要免疫器官，如扁桃體、下頜淋巴結(jié)、肺門(mén)淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟等。

1.12 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄取感染后不同時(shí)間采集的各器官，按照 High Pure RNA Tissue Kit說(shuō)明書(shū)提取總RNA。利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，程序?yàn)?25℃ 10 min，55℃ 1 h，85℃ 5 min。

1.13 各組織中病毒載量的檢測(cè)以各組織反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)條件熒光定量PCR反應(yīng)液用Roche 公司生產(chǎn)的 FastStart TaqMan Probe Master試劑盒。篩選出的最佳反應(yīng)體系:RNA模板2 μL，PRRSV-F/PRRSV-R（10 pmol/μL） 各 1 μL，TaqMan 探針（10 pmol/μL）0.4 μL。循環(huán)參數(shù):95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)后檢測(cè)熒光。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立取濃度為 104～108拷貝 /μL 的標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-3.1843x+39.241867，相關(guān)系數(shù)為R2=0.99，見(jiàn)圖1。

圖1 繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve established from the abovemention result

2.3 靈敏性試驗(yàn)將系列稀釋的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示本方法比普通PCR方法高10～100倍，具有較好的靈敏度。

2.4 特 異 性 試 驗(yàn)CSFV、JEV、PCV2和 PRRSV JXl43核酸作為模板，利用熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，其中，PRRSV的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而其他病毒核酸的結(jié)果均為陰性，表明該方法具有較好的特異性。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)用熒光定量PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了重復(fù)性檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性測(cè)定Table 1 Ct value of PRRSV standard preparation

2.6 臨床癥狀及剖檢變化攻毒后3 d，實(shí)驗(yàn)組豬出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、食欲下降、飲水減少，部分仔豬下痢，日漸消失。攻毒后7 d，豬出現(xiàn)咳嗽、眼角分泌物增多。攻毒后14 d，實(shí)驗(yàn)組豬體溫明顯升高。但整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中并未出現(xiàn)癱瘓、耳部和皮膚發(fā)紺等藍(lán)耳病的典型癥狀。實(shí)驗(yàn)組豬出現(xiàn)典型的肺出血、淤血病變、彌漫性間質(zhì)性肺炎；皮下、扁桃體、肝臟均出現(xiàn)出血點(diǎn)和出血斑；全身淋巴結(jié)都有不同程度的淤血、出血、腫脹，有點(diǎn)呈現(xiàn)暗紅色（見(jiàn)圖2）。

圖2 萊蕪黑豬剖檢病理變化Fig.2 Anatomic pathological changes of Laiwu black pigs

2.7 各臟器和淋巴結(jié)中病毒載量萊蕪黑豬攻毒PRRSV后，不同時(shí)間各種組織中的病毒核酸拷貝數(shù)，見(jiàn)表2。由表2可知，攻毒后d 3各組織中均檢測(cè)到病毒核酸存在。攻毒后d 7，在各組織中病毒載量明顯增高，扁桃體、下頜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)等淋巴組織中的病毒載量均達(dá)到107拷貝/g以上，心臟、肝臟、腎臟、脾臟、下頜淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)在攻毒后d 7達(dá)到該組織病毒載量最高值，而肺臟和扁桃體在攻毒后d 14達(dá)到病毒載量最高，另外腹股溝淋巴結(jié)的病毒載量在攻毒后d 21 達(dá)到最高值。

整體來(lái)看，攻毒后d 7～21，各種組織中的病毒載量維持在較高水平，而攻毒后d 28時(shí)，多數(shù)組織中的PRRSV病毒含量明顯下降。扁桃體、下頜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)等淋巴組織中的病毒載量要明顯高于其他臟器，顯示PRRSV在感染萊蕪黑豬后具有淋巴組織組織嗜性。

表2 攻毒后各組織中病毒拷貝數(shù)Table 2 Virus copies in different tissues after infection

2.8 PRRS是一種困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要免疫抑制病，PRRSV單獨(dú)感染能引起免疫器官以淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞變性壞死為特征的急性炎癥變化，造成免疫損傷，進(jìn)而引起免疫抑制[16]。感染PRRSV后豬體在接種其他疫苗時(shí)不能產(chǎn)生正常的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，容易繼發(fā)其他病原的感染[6]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相對(duì)于常規(guī)PCR等病原檢測(cè)方法，不僅有著更高的特異性和靈敏度，而且大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，還可應(yīng)用于病毒隱性感染和早期感染的診斷[17]?；赟YBR Green法的熒光定量PCR分析融解曲線(xiàn)顯示，兩種不同型PRRSV分別得到不同的融解溫度，可用于PRRSV的流行病學(xué)調(diào)查[18]。本研究建立的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)PRRSV的方法相對(duì)于SYBR Green法具有更高的特異性，在進(jìn)行PRRSV定量檢測(cè)時(shí)更加可靠。

萊蕪豬是我國(guó)華北地區(qū)優(yōu)良地方品種豬，抗病性強(qiáng)是其主要優(yōu)點(diǎn)之一。本研究以PRRSV攻毒健康萊蕪黑豬仔豬，檢測(cè)攻毒后不同時(shí)間段萊蕪黑豬各種組織中的病毒核酸載量。結(jié)果顯示，攻毒后d 3各組織器官中均檢測(cè)出低拷貝的病毒；攻毒后d 7，各組織中病毒載量明顯增高；攻毒后d 7～21，各種組織中的病毒載量維持在較高水平，而在攻毒后d 28時(shí)，多數(shù)組織中的PRRSV病毒含量明顯下降。扁桃體、下頜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)等淋巴組織中的病毒載量在攻毒d 7后均達(dá)到107拷貝/g以上，明顯高于其他的組織，表明PRRSV感染萊蕪黑豬后各種免疫組織是其侵害的主要部位，并可能因此影響免疫組織發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制。

危艷武等[15]用高致病性PRRSV變異株攻毒健康仔豬后檢測(cè)出扁桃體、淋巴結(jié)、心臟和腎臟中病毒核酸載量較高，并且扁桃體和淋巴結(jié)中病毒核酸載量明顯低于腎臟。本研究發(fā)現(xiàn)萊蕪黑豬心臟中的PRRSV病毒核酸載量在各種組織中較低，且扁桃體和淋巴結(jié)中病毒核酸載量在檢測(cè)周期中多數(shù)情況下顯著高于腎臟，推測(cè)二者差異的主要原因可能是使用的攻毒毒株以及試驗(yàn)動(dòng)物不同所致。本研究由于試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量所限，某些試驗(yàn)數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，個(gè)體之間差異較為明顯，這與危艷武等[15]的試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。今后的研究中增加試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量是減少個(gè)體差異、獲得更為客觀(guān)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果的有效措施。

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