尹曉玲 王正中 趙銀晶 陳華俊 楊曉瓊 梁后杰 (重鋼總醫(yī)院腫瘤科，重慶 400081)

結(jié)腸癌是常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，目前雖有手術(shù)、化療、生物治療等常規(guī)手段，但結(jié)腸癌總生存率并未提高。許多研究表明，腫瘤細(xì)胞群中有小部分特殊細(xì)胞即癌癥干細(xì)胞(Cancer stem cell，CSCs)的存在，且CSCs與腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和對(duì)傳統(tǒng)治療是否敏感密切相關(guān)［1，2］。越來越多的證據(jù)支持結(jié)腸 CSCs的存在［3，4］，并且可能是腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的主要原因。

眾所周知，大多數(shù)傳統(tǒng)治療方法不能靶向CSCs。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠IL-12重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細(xì)胞后進(jìn)行瘤內(nèi)注射可產(chǎn)生明顯的抗瘤免疫作用［5，6］，相關(guān)研究支持細(xì)胞因子對(duì)CSCs同樣具有作用，因此我們推測(cè)IL-12對(duì)CSCs可能同樣有作用［7］。我們前期試驗(yàn)證實(shí) CD133+CD44+結(jié)腸CSCs如SW480細(xì)胞上清液不能測(cè)到IL-12，說明CD133+CD44+結(jié)腸CSCs不表達(dá)或低表達(dá)IL-12。IL-12是主要由抗原遞呈細(xì)胞(APC)如單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子［8］，人IL-12對(duì)腎癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、黑色素瘤及卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移的患者均有不同程度的臨床效應(yīng)［9-14］，瘤內(nèi)注射 Ad．IL-12(腺病毒IL-12)可行并且安全［15］。

基于這些結(jié)果，我們推測(cè)構(gòu)建 IL-12過表達(dá)CSCs模型將有效抑制CSCs生存及腫瘤生長(zhǎng)。本研究利用高效轉(zhuǎn)染的慢病毒作為載體構(gòu)建IL-12過表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染結(jié)腸 CSCs，RT-PCR及 Western blot觀察其在結(jié)腸CSCs表達(dá)及對(duì)其“干性”的(自我更新及分化)影響，為進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/F12及DMEM(高糖)、胎牛血清、重組表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF-2)均購于Gibco公司。含綠色熒光蛋白GFP的慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒(pGCFU)購于Genechem公司;pORF-hIL-12 G2質(zhì)粒購于InvivoGen公司;CCK-8試劑盒購于江蘇碧云天公司;胰酶、DEPC、Tris堿、EDTA均購于 Sigma公司;抗人CD133/PE抗體及抗人CD44/APC抗體購于BD Pharmingen公司;BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher Scientific;限制性內(nèi)切酶(HindⅢ及EcoRⅠ)購于NEB公司產(chǎn)品;DL-2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品購于TaKaRa生物公司;總RNA提取試劑盒購于上海生工;質(zhì)粒抽提試劑盒購于Promega公司，Taq聚合酶購于Genotech公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480由本教研室傳代保存，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，含20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF-2、1×B27和1% 青鏈霉素)篩選培養(yǎng)2周后，流式細(xì)胞儀分選出CD133+CD44+SW480細(xì)胞。

1．3 結(jié)腸癌CSC的篩選及鑒定 結(jié)腸癌細(xì)胞條件培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀分選結(jié)腸癌干細(xì)胞:結(jié)腸癌SW480細(xì)胞(購于ATCC)接種于低吸附96孔板(200個(gè)細(xì)胞/孔)，在干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，篩選出未分化腫瘤細(xì)胞，慢慢增殖，形成細(xì)胞團(tuán)塊，即“腫瘤球”。繼續(xù)培養(yǎng)1～2周，反復(fù)吹打使原始球解聚，移至培養(yǎng)板中再培養(yǎng)增殖。細(xì)胞分四組:①分別加入10μl PE(Phycoerythrim，藻紅蛋白)標(biāo)記的小鼠抗人CD133單克隆抗體及APC(Allophycocyanin，別藻青蛋白)標(biāo)記的小鼠抗人CD44單克隆抗體;②加入10μl PE標(biāo)記的小鼠抗人CD133單克隆抗體;③加入10μl APC標(biāo)記的小鼠抗人CD44單克隆抗體;④加10μl PBS作為空白對(duì)照。充分混合，4℃暗處孵育20分鐘。洗滌，離心，重懸細(xì)胞上機(jī)分選。

富集CD133+CD44+細(xì)胞作為結(jié)腸CSCs，分選出的CSCs用干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2孵箱中。

1．3．1 CD133+CD44+SW480細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將分選得到的CD133+CD44+SW480及CD133－CD44－SW480細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度至5×104m l－1，分別接種于6 塊96 孔板中，0．1 ml/每孔，3 復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照孔調(diào)零，5%CO2、37℃培養(yǎng)。分別在0、1、2、3、4和 5天隨機(jī)選取1個(gè)96孔板，每孔加入10μl的CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各吸光度值(A450)，取各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞吸光度的平均值，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，A450為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1．3．2 CD133+CD44+SW480 細(xì)胞克隆形成能力調(diào)整 CD133+CD44+SW480細(xì)胞和 CD133－CD44－SW480細(xì)胞濃度至1×104ml－1。接種于6孔板中，5%CO2，37℃培養(yǎng)2～3周。當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS液浸洗3次。加入5 ml甲醇固定15分鐘，姬姆薩染液染色10分鐘，倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1．3．3 CD133+CD44+SW480 及 CD133－CD44－SW480細(xì)胞無血清培養(yǎng)成球能力 調(diào)整CD133+CD44+SW480細(xì)胞和CD133－CD44－SW480細(xì)胞濃度。各取10 000個(gè)兩組細(xì)胞分別加入6孔板中，5%CO2，37℃培養(yǎng)。隔日換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，7天后終止培養(yǎng)。

1．3．4 NOD/SCID體內(nèi)成瘤能力 雌性 NOD/SCID鼠15只(n=5)，5～6周齡，體重25～30 g，飼養(yǎng)在無特定病原體(Specific pathogen-free，SPF)級(jí)的潔凈層流架內(nèi)。分別將CD133+CD44+SW480細(xì)胞和CD133－CD44－SW480細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。常規(guī)消毒皮膚，按 100/只、1 000/只、10 000/只接種到裸鼠雙側(cè)前肢背部皮下。接種后每周兩次觀察小鼠，6周后處死小鼠，統(tǒng)計(jì)不同亞群細(xì)胞的成瘤情況。

1．4 構(gòu)建IL-12慢病毒表達(dá)載體 構(gòu)建重組IL-12p70慢病毒質(zhì)粒:根據(jù)Genbank中人IL-12 cDNA序列(IL12A GeneID:3592，IL12B GeneID:3593)設(shè)計(jì)PCR引物，引物含同源重組序列、HindⅢ及EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。上游引物為:5'TCCCCCGGGCCACCATGGGTCACCAGCA 3'，下游引物為:5'ACCG-GAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAG 3'。用 E．coli Fast-Media?Amp培養(yǎng)基(液)擴(kuò)增含 pORF-hIL-12 G2質(zhì)粒的E．coli菌，抽提質(zhì)粒 DNA，以 pORF-h IL-12 G2質(zhì)粒為模板通過PCR擴(kuò)增IL-12p70。

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收后通過雙酶切，將IL-12p70 DNA片段與pGC-FU載體連接，將IL-12p70基因片段交換插入pGC-FU，獲得重組質(zhì)粒 pGC-FU-IL-12。同時(shí)以pGC-FU-GFP-LV病毒為陰性對(duì)照。

菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送華大基因測(cè)序，測(cè)序正確的克隆搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用除內(nèi)毒素DNA抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用于病毒包裝，并進(jìn)行IL-12慢病毒過表達(dá)載體的滴度檢測(cè)。

1．5 重組腫瘤干細(xì)胞模型的建立以及鑒定 IL-12過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸CSCs:轉(zhuǎn)染前一天，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CD133+CD44+SW480細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，用不含抗生素的干細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞到24孔板，5×104細(xì)胞/孔。分組:①未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組;②IL-12過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組;③空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。在EP管里分別加入50μl Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium 和0．8μg IL-12過表達(dá)慢病毒載體DNA，輕柔混勻，制成DNA稀釋液。在另一個(gè)EP管里分別加入50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 和 2．0 μl TransLipid，制成TransLipid稀釋液，室溫靜置5分鐘。將兩種稀釋液輕柔混合，室溫靜置20分鐘，形成DNA-TransLipid復(fù)合物。將該復(fù)合物加入到接種好的細(xì)胞中，37℃，5%CO2培養(yǎng)6小時(shí)后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后將細(xì)胞按照1∶10的比例接種到新鮮培養(yǎng)基中，第二天加入選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞稱作慢病毒-IL-12。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞碎片，然后將上清用0．45μm的PVDF濾膜過濾，RT-PCR和 Western blot檢測(cè)培養(yǎng)上清液IL-12表達(dá)。

1．5．1 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-12基因表達(dá)按說明書抽提細(xì)胞培養(yǎng)上清總RNA，室溫干燥5～10分鐘至RNA呈半透明狀，加入30μl DEPC處理過的水溶解，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。抽取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后用于PCR擴(kuò)增。RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳分析。

1．5．2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-12蛋白表達(dá) 用蛋白抽提試劑盒-Ⅱ提取，濃縮上清至原體積的1/30～1/10，即為細(xì)胞上清液總蛋白。蛋白樣品按照1∶4的比例加入5×上樣緩沖溶液，100℃變性5分鐘，BCA法測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE垂直電泳，電轉(zhuǎn)膜，抗原-抗體反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光法顯色，通過在BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行掃描及圖像分析。用相對(duì)灰度值表示蛋白相對(duì)含量。

1．6 IL-12 對(duì)結(jié)腸 CSCs“干性”的影響

1．6．1 IL-12對(duì)結(jié)腸CSCs克隆形成能力的影響將轉(zhuǎn)染 IL-12過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒及未轉(zhuǎn)染的CD133+/CD44+SW480細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度。各取10 000個(gè)兩組細(xì)胞分別加入6孔板中，加入適量條件培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)。每隔1天半量換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，7天后終止培養(yǎng)。

1．6．2 IL-12對(duì)結(jié)腸CSCs分化的影響 為了觀察IL-12對(duì)結(jié)腸CSCs的體外分化能力的影響，我們?nèi)∞D(zhuǎn)染IL-12過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的CD133+CD44+SW480在條件培養(yǎng)基中形成的克隆細(xì)胞球，移入含10%胎牛血清培養(yǎng)基中連續(xù)觀察其生長(zhǎng)情況，1周后用SP免疫組化試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞CK20表達(dá)(結(jié)果判斷:被測(cè)細(xì)胞胞漿染色黃-棕色為陽性表達(dá))，同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞中CD133+CD44+SW480比例。

2 結(jié)果

2．1 流式細(xì)胞儀分選出CD133+CD44+SW480細(xì)胞 經(jīng)條件培養(yǎng)的SW480細(xì)胞含有(90．8±4．5)%CD133+CD44+細(xì)胞(圖1A)，并能形成典型的“神經(jīng)球”結(jié)構(gòu)，而 PBS空白對(duì)照組只有(1．2±0．3)%CD133+CD44+細(xì)胞(圖 1B)，皮下接種 100個(gè)CD133+CD44+SW480細(xì)胞和CD133－CD44－SW480細(xì)胞均不能成瘤;接種1 000個(gè)/只CD133+CD44+小鼠中有2只成瘤，接種 10 000個(gè)/只 CD133+CD44+小鼠均能在2周內(nèi)成瘤，而1 000個(gè)/只及10 000個(gè)/只CD133－CD44－在6周內(nèi)均不能成瘤。因此我們推測(cè)SW480細(xì)胞株中存在干細(xì)胞。

CD133+CD44+SW480細(xì)胞于條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，單細(xì)胞、圓形、透亮。培養(yǎng)3天后，細(xì)胞成球形懸浮生長(zhǎng)(圖2A)。到第7天時(shí)形成較大的腫瘤細(xì)胞球，形態(tài)大小各異，而且較前致密(圖2B)。將懸浮細(xì)胞球移入含10%胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)4小時(shí)后，細(xì)胞變?yōu)樗笮?，少部分開始貼壁生長(zhǎng);24小時(shí)后完全貼壁生長(zhǎng)(圖2C)。CD133－/CD44－SW480培養(yǎng)2周均不能形成細(xì)胞球(圖2D)。與 CD133－CD44－SW480相比，CD133+CD44+SW480有更強(qiáng)的增殖能力，至第5天，細(xì)胞增殖明顯，曲線變陡直，而CD133－CD44－SW480曲線較平坦。對(duì)各時(shí)間點(diǎn)A450進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩組細(xì)胞間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2E)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示:培養(yǎng)3周后，CD133+CD44+SW480形成的細(xì)胞克隆數(shù)為271．22 ±57，而 CD133－/CD44－SW480 為 22．24 ±6．56。提示CD133+CD44+SW480具有更強(qiáng)的克隆形成能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，圖2F)。

圖1 流式細(xì)胞儀分選CD133+CD44+SW 480結(jié)腸癌干細(xì)胞Fig．1 CD133+/CD44+SW 480 colon CSCs was sorted by flow cytometry

圖2 CD133－CD44－SW 480及CD133+CD44+SW 480在不同培養(yǎng)基中增殖克隆Fig．2 CD133－CD44－ SW 480 and CD133+CD44+SW 480 proliferated in differentmedium

2．2 慢病毒-IL-12表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功并抑制CD133+CD44+SW480自我更新 IL-12基因及慢病毒載體通過雙酶切及連接，成功構(gòu)建慢病毒-IL-12表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，膠回收得到長(zhǎng)約1 700 bp的目的基因片段。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中的目的片段與Genebank中的序列符合，證實(shí)IL-12基因已成功克隆到慢病毒載體。以上結(jié)果證實(shí)慢病毒-IL-12表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將293T細(xì)胞包裝病毒24小時(shí)后，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)大小不等的綠色熒光顆粒，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖3B)，收獲病毒并濃縮，對(duì)包裝病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)，IL-12慢病毒平均滴度3．5×108ml－1，結(jié)果表明成功的進(jìn)行了慢病毒-IL-12的包裝，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

RT-PCR和 Western blot檢測(cè)表明，將慢病毒-IL-12或空載體(空白對(duì)照)轉(zhuǎn)染CD133+CD44+SW480，慢病毒-IL-12上清液表達(dá) IL-12 mRNA(圖3C)和蛋白(圖3D)，但空白對(duì)照無表達(dá)，而結(jié)腸細(xì)胞WM35上清也表達(dá)IL-12 mRNA和蛋白，但表達(dá)水平明顯低于慢病毒-IL-12。將CSCs懸浮于無血清的CSCs培養(yǎng)液中，腫瘤球形成后光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤球數(shù)量。值得注意的是，轉(zhuǎn)染IL-12/慢病毒重組體的CSCs不能形成明顯的腫瘤球(說明增殖率降低)(圖3E)。而未轉(zhuǎn)染IL-12/慢病毒重組體的CSCs形成表型和結(jié)構(gòu)上和初代基本相同的克隆球(圖3F)。結(jié)果顯示IL-12降低了結(jié)腸CSCs自我更新能力。

2．3 IL-2對(duì)結(jié)腸CSCs分化的影響 為了觀察IL-12對(duì)結(jié)腸CSCs體外分化能力的影響，轉(zhuǎn)染后1周，我們分別將轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染IL-12-慢性毒重組體的CSCs移入含10%小牛血清培養(yǎng)基中連續(xù)觀察其生長(zhǎng)情況，我們發(fā)現(xiàn):克隆細(xì)胞球于接種后24小時(shí)貼壁生長(zhǎng)，隨后的幾天有分化的貼壁細(xì)胞從細(xì)胞球中游出，并逐漸形成成片貼壁細(xì)胞。我們對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比(圖4B)，IL-12增加CSCs分化標(biāo)志CK20表達(dá)(圖4A)，同時(shí)降低 CSCs CD133+CD44+SW480比例(圖4C)，說明其可能促進(jìn)CSCs分化。

圖3 慢病毒-IL-12轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，IL-12表達(dá)及對(duì)細(xì)胞自我更新的影響Fig．3 IL-12 expression and it’s effects on cell self-renewal after lentivirus/IL-12 transfected in cell

圖4 IL-12促進(jìn)結(jié)腸CSCs分化Fig．4 IL-12 promote colon CSCs differentiation

3 討論

最近研究表明，CSCs能夠始發(fā)免疫缺陷小鼠腫瘤生長(zhǎng)［1，2］，并與腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)相關(guān)。從理論上講，靶向CSCs治療能夠徹底消除腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，因此靶向CSCs的腫瘤治療策略將比目前的傳統(tǒng)治療方法能更有效地根治腫瘤，減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，為腫瘤的靶向診治提供了新靶標(biāo)，為根治腫瘤帶來了新希望。關(guān)于CSCs特異性的表面標(biāo)志物目前尚無定論，根據(jù)目前國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，采用雙抗體標(biāo)記CSCs也許是一種更好的選擇，因此本研究我們聯(lián)合CD133和CD44兩種抗體富集CSCs，并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)條件培養(yǎng)的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞分選后CD133CD44陽性表達(dá)率為(90.8±4.5)%，通過無血清成球、增殖、克隆形成和小鼠體內(nèi)致瘤能力對(duì)其“自我更新能力”進(jìn)行了初步鑒定，證實(shí)結(jié)腸癌SW480存在CSCs。

免疫抑制仍是多數(shù)預(yù)期較好的腫瘤治療手段的主要障礙，而細(xì)胞因子失衡是機(jī)體免疫功能紊亂的主要原因，并導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展及復(fù)發(fā)。關(guān)于細(xì)胞因子的抗瘤免疫反應(yīng)相關(guān)研究包括 IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12等，已有研究表明，IL-12能有效地增多腫瘤的抗瘤免疫反應(yīng)，但I(xiàn)L-12對(duì)CSCs是否同樣有作用并不清楚。

慢病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIVⅠ)病毒，包裝后能產(chǎn)生攜帶目的基因的重組慢病毒(是一類缺陷病毒)，離開包裝細(xì)胞后病毒顆粒僅能轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，但不能自我復(fù)制，此為其安全性提供了更為有效的保證。慢病毒載體既能感染分裂活躍期的細(xì)胞，又能高效率感染分裂緩慢或非分裂期的細(xì)胞;能夠攜帶較大及多個(gè)外源性基因，轉(zhuǎn)染后對(duì)轉(zhuǎn)錄沉默作用有較強(qiáng)的抵抗力，能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的基因;另外還具有感染效率高、免疫反應(yīng)低等特點(diǎn)。根據(jù)慢病毒載體的特性，本研究選用慢病毒作為攜帶目的基因的載體。

本研究中，我們成功構(gòu)建含IL-12 cDNA的重組慢病毒質(zhì)粒，用包裝病毒的工具細(xì)胞293T細(xì)胞包裝純化后，獲得較高滴度的病毒顆粒，將其轉(zhuǎn)染CD133+/CD44+SW480細(xì)胞，慢病毒-IL-12細(xì)胞高表達(dá)IL-12 mRNA及蛋白，說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-12的結(jié)腸CSCs系建立，同時(shí)也證明慢病毒作為基因研究的載體具有低毒、高效的優(yōu)勢(shì)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-12促進(jìn)分化標(biāo)志CK20表達(dá)，降低CD133+CD44+SW480細(xì)胞比例，說明IL-12可促進(jìn)結(jié)腸CSCs分化;另一方面，IL-12抑制結(jié)腸CSCs成球，說明IL-12可抑制結(jié)腸CSCs增殖。本研究為進(jìn)一步研究IL-12對(duì)結(jié)腸CSCs惡性表型的影響奠定基礎(chǔ)，為細(xì)胞因子進(jìn)行CSCs治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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