徐秀章 夏文杰 葉 欣 丁浩強(qiáng) 陳揚(yáng)凱 鄧 晶 邵 媛 王嘉勵(lì)

(廣州血液中心臨床輸血研究所，廣州 510095)

人類中性粒細(xì)胞除表達(dá)人類白細(xì)胞抗原、紅細(xì)胞ABH抗原等共有抗原外，還表達(dá)特有的糖蛋白，稱為中性粒細(xì)胞抗原(Human neutrophil antigen，HNA)。自1960年 Lalezari［1］發(fā)現(xiàn)首個(gè)人類中性粒細(xì)胞抗原以來，目前已檢出并命名了HNA1～5系統(tǒng)中的8個(gè)HNA抗原。研究證明［2］，中性粒細(xì)胞抗原在中性粒細(xì)胞的免疫激活和輸血相關(guān)性疾病方面起著重要作用，其抗體可導(dǎo)致多種臨床病癥，如同種免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、藥物依賴性中性粒細(xì)胞減少癥、骨髓移植后移植物被排斥及輸血相關(guān)性急性肺損傷(TRALI)。在HNA系統(tǒng)中，人類中性粒細(xì)胞抗原－2a(HNA－2a)因其臨床重要性而受到廣泛關(guān)注。

HNA－2a之前被稱為 NB1，由 19號染色體19q13．3區(qū)域的 CD177基因編碼，分子量為56－64 kD。CD177基因的cDNA由1 311個(gè)堿基組成，編碼437個(gè)氨基酸，其中包括21個(gè)氨基酸的信號肽［3］。NB1糖蛋白屬于LY6基因家族，且與Ly－6基因家族的另一成員PRV－1具有高度的同源性，目前已被證實(shí)是一對等位基因［4］。PRV－1基因在真性紅細(xì)胞增多癥患者的中性粒細(xì)胞上大量表達(dá)，且與NB1基因之間存在4個(gè)堿基的區(qū)別，其中外顯子1第42位置上的堿基取代決定HNA－2a系統(tǒng)的抗原特異性，故多通過該位置對中性粒細(xì)胞的CD177進(jìn)行基因分型。HNA－2a是一種高頻率抗原，其中在97%的高加索人、95%的非裔美國人及99．5%的日本中表達(dá)［4－7］。有3% ～5%的健康人表達(dá)非常低的HNA－2a，甚至有極少部分表達(dá)量＜5%，稱為 HNA－2－null型。目前認(rèn)為 HNA－2－null型的產(chǎn)生與 mRNA合成過程中的剪切錯(cuò)誤有關(guān)［2］。在HNA－2a表達(dá)陽性的個(gè)體中，并非所有的中性粒細(xì)胞都表達(dá)HNA－2a。在0%－100%范圍內(nèi)的中性粒細(xì)胞有不同程度的 HNA－2a 表達(dá)(55% ±22%)［8］，且其表達(dá)量受多種因素的影響，研究發(fā)現(xiàn) CD177基因的 SNPs與HNA－2a的表達(dá)水平相關(guān)。

本研究旨在通過PCR－SBT方法對中性粒細(xì)胞CD177(G42C)基因型進(jìn)行檢測，獲得中國廣東人群的CD177的基因型;同時(shí)也采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測該人群HNA－2a的表達(dá)，結(jié)合其基因型對可能影響HNA－2a表達(dá)的幾個(gè)因素(SNPs、年齡及性別)進(jìn)行初步探討。

1 對象與方法

1．1 研究對象 隨機(jī)抽取83份體檢正常的無血緣關(guān)系的廣東籍無償獻(xiàn)血者，其中男53例，女30例，年齡介于20～54歲。每例標(biāo)本抽取EDTA抗凝血10 ml。

1．2 主要儀器和材料 淋巴細(xì)胞分離液(密度ρ:1．077±0．002)購自上海華精生物高科技有限公司;DPBS購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司;CD177－FITC(MEM－166)和鼠抗 IgG－FITC 抗體均購自美國BioLegend公司;EPICS－XL流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司;MJPTC－200PCR擴(kuò)增儀;全血DNA提取試劑盒(購自德國QIAGEN公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP);3130測序儀(購自美國ABI公司)。

1．3 方法

1．3．1 中性粒細(xì)胞分離 將2 ml生理鹽水加入新鮮采集的全血中，混勻，再緩慢加入4 ml的淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r/min，離心20分鐘。棄上層血清及淋巴細(xì)胞，洗滌后加入1×氯化銨溶血素，冰上裂解5分鐘，1 500 r/min離心5分鐘，如紅細(xì)胞裂解不充分，可進(jìn)一步裂解。用DPBS洗滌2次后，用1 ml的0．2%BSA/DPBS重懸，上機(jī)計(jì)數(shù)并將中性粒細(xì)胞的濃度調(diào)整為 3×106ml－1。

1．3．2 流式細(xì)胞儀檢測 分別取1．3．1中的粒細(xì)胞懸液100μl加入到兩支FACS管中，一管再加入2μl的MEM－166，另一管加入2μlm IgG(每個(gè)樣本均設(shè)有對照管)，4℃避光孵育20分鐘。之后加入2．5 ml的 0．2%BSA/DPBS，以 1 500 r/min 離心 5分鐘，棄上清。最后用300μl的0．2%BSA/DPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)讀數(shù)。

1．3．3 基因組 DNA提取 EDTA抗凝靜脈血5 ml，按試劑盒提取DNA(詳細(xì)步驟見QIAGEN DNA提取試劑盒說明書)，－20℃保存。

1．3．4 PCR擴(kuò)增及測序 合成PCR擴(kuò)增引物:5HNA－2a:5'－GAGAGATTACCAGCCACAGACG－3';3HNA－2a:5'－GCACAGGGATCAAGGGAC－3'。 擴(kuò) 增條件為94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，63℃退火30秒和72℃延伸30秒，共30循環(huán)，72℃最后延伸5分鐘后冷卻至4℃。對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切純化后，將擴(kuò)增引物作為測序引物進(jìn)行測序PCR，反應(yīng)條件如下:96℃預(yù)變性2分鐘，96℃變性10秒，50℃退火5秒和60℃延伸4分鐘，共25循環(huán)。純化變性后上機(jī)測序。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對83例CD177基因型測序結(jié)果和HNA－2a表達(dá)量的流式檢測結(jié)果進(jìn)行T－檢驗(yàn)和單因素方差分析，若P＜0．05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 廣東人群中中性粒細(xì)胞HNA－2a的表達(dá)與年齡及性別的關(guān)系 通過流式細(xì)胞術(shù)對83名廣東籍無償獻(xiàn)血者HNA－2a的表達(dá)進(jìn)行檢測，其表達(dá)量均超過5%(HNA－2a表達(dá)量低于5%，認(rèn)為HNA－2a表達(dá)陰性)。HNA－2a在83例獻(xiàn)血者的中性粒細(xì)胞表達(dá)的百分比為61．37%±17．87%，MFI為4．87±1．41(見表 1、圖 1)。對不同性別及女性不同年齡段(≥40歲者與＜40歲者)HNA－2a的表達(dá)量進(jìn)行T－檢驗(yàn)，P＞0．05，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，男性與女性對HNA－2a的表達(dá)無明顯差異，且女性隨著年齡的增加對HNA－2a的表達(dá)量亦無明顯影響。

表1 不同性別及年齡對HNA-2a表達(dá)的影響Tab．1 The effects of gender and age on HNA-2a expression in Guangdong population

表2 CD177的基因型及HNA-2a流式表達(dá)結(jié)果Tab．2 CD177 genotype and the results of HNA-2a exp ression by flow cytometry

2．2 中國廣東人群 CD177的基因型及 SNPs對HNA－2a表達(dá)的影響 根據(jù)CD177基因在1號外顯子42位的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，采用PCR－SBT法對83份標(biāo)本的 CD177進(jìn)行基因分型，表現(xiàn)為42C/C、42C/G和42G/G三種基因型，其中42C/C與42C/G為中國廣東人群中常見的CD177基因型，分別占48．19%與44．58%;而42G/G較少見，僅占7．23%(見表2、圖2)。

此外，對不同基因型的無償獻(xiàn)血者 HNA－2a的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析(見表2)，統(tǒng)計(jì)顯示，42C/C與42G/G基因型之間，其 HNA－2a表達(dá)的MFI存在顯著影響(P=0．047＜0．05)，表明 G42C 基因多態(tài)性可影響HNA－2a的表達(dá)。

3 討論

圖1 HNA-2a表達(dá)的流式細(xì)胞分析結(jié)果Fig．1 Flow cytometry of HNA-2a expression

圖2 HNA-2a基因分型測序結(jié)果Fig．2 The genotype of HNA-2a analyzed by nucleotide sequencing

HNA－2a作為GPⅠ連接膜糖蛋白僅表達(dá)于中性粒細(xì)胞亞群［9，10］，且表達(dá)存在明顯的個(gè)體差異。研究認(rèn)為可能與以下兩個(gè)機(jī)制有關(guān)［4，11－15］:一，機(jī)體狀態(tài)的影響，激素、炎癥、感染、接受G－CSF治療及骨髓增生性疾病等因素可影響CD177的基因調(diào)控和蛋白加工，從而導(dǎo)致HNA－2a表達(dá)增加。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道HNA－2a在中性粒細(xì)胞的表達(dá)，女性高于男性，特別是妊娠期婦女HNA－2a中性粒細(xì)胞數(shù)明顯增加［12］。二，基因水平的影響，CD177是一個(gè)多態(tài)性基因，一些高頻的SNPs可能會影響到中性粒細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)，例如 G42C。A793C及 G1084A等，其中最常見的SNPs為G42C，單核苷酸其多態(tài)性使得參與細(xì)胞從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到質(zhì)膜和次級顆粒進(jìn)行蛋白搬運(yùn)的前導(dǎo)序列的氨基酸發(fā)生改變，從而影響到細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá)量［16］。

本研究首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測中國廣東人群HNA－2a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) 83例無償獻(xiàn)血者均表達(dá)HNA－2a 抗原，其表達(dá)量為61．37% ±17．87%。本實(shí)驗(yàn)也對HNA－2a在不同性別及女性的不同年齡段的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示女性與男性之間HNA－2a的表達(dá)量無差異，且 HNA－2a在≥40歲與＜40歲女性中性粒細(xì)胞之間的表達(dá)無明顯區(qū)別，此與之前文獻(xiàn)報(bào)道的不一致［12］。分析原因可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量少有關(guān);亦或者雌激素并不影響HNA－2a的表達(dá)。其次，通過對83名健康無償獻(xiàn)血者CD177基因(G42C)進(jìn)行測序分析，獲得中國廣東人群基因型結(jié)果是42C/C和42C/G多見，而42G/G 少見，分別占 48．19%、44．58%和 7．23%。而Caruccio等［4］得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是42G/G與42C/C 多見，42C/G 較少見，分別占50．00%、43．75%及6．25%，兩者結(jié)果存在很大差異，分析原因可能與人種不同有關(guān)。因?yàn)楸狙芯恐塾谖挥谥袊戏降貐^(qū)的廣東人群，而Caruccio等研究人群則由11名非裔美國人和12名高加索人組成，兩者在人種遺傳和地域等方面存在很大差距，故初步推測中國廣東人群CD177基因的G42C存在其獨(dú)特性。本研究亦分析CD177基因的G42C多態(tài)性對HNA－2a表達(dá)量的影響，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，42C/C基因型獻(xiàn)血員其HNA－2a表達(dá)的MFI明顯高于42G/G基因型者(P＜0．05)，表明SNPs(G42C)會影響HNA－2a的表達(dá)量。

總之，NB1作為最重要的中性粒細(xì)胞抗原之一是目前輸血免疫領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，其臨床重要性在國外得到廣泛地關(guān)注，但國內(nèi)對HNA－2a的研究甚少。本研究通過PCR－SBT方法和流式細(xì)胞術(shù)，獲得了中國廣東人群CD177的基因型及HNA－2a的表達(dá)情況，并對影響HNA－2a表達(dá)的幾個(gè)因素進(jìn)行了初步探討，這對今后對NB1功能研究及由NB1引起的臨床輸血相關(guān)性疾病的研究提供了理論基礎(chǔ)。

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