郭建巍 秦力維 馮健男 付凱飛 王珍光 趙強(qiáng)元

(海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100048)

研究和開發(fā)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期、高效和持久免疫應(yīng)答的、黏膜免疫佐劑是感染免疫和疫苗領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重點(diǎn)［1-5］。蓖麻毒素(ricin)B鏈(RTB)含有兩個(gè)半乳糖結(jié)合部位，幾乎能與所有真核細(xì)胞上含半乳糖基的糖蛋白或糖酯結(jié)合。由于RTB與巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的這一獨(dú)特性質(zhì)，有學(xué)者在疫苗研制中使用RTB將抗原直接靶向抗原呈遞細(xì)胞，并取得了良好的免疫效果［6-10］。

本課題組在前期研究中獲得一株與RTB特異性結(jié)合的中和性單抗3E1，可在體內(nèi)外完全阻斷各種細(xì)胞與RTB結(jié)合［11］。本研究擬通過生物信息學(xué)技術(shù)，確定RTB與細(xì)胞特異性結(jié)合的活性肽部位，構(gòu)建含不同肽的綠色熒光蛋白原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)肽-綠色熒光蛋白融合蛋白在大腸桿菌中的高效、可溶性表達(dá)。通過小鼠舌下口服肽-GFP融合蛋白后［12］，初步評(píng)價(jià)GFP在不同RTB有效組分靶向下在體內(nèi)的分布，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)軟件 計(jì)算機(jī)理論模擬所用硬件為美國IBM圖形工作站(Intellistation Z Pro);軟件為Dock 5.4(Kuntz I.D，UCSF);SYBYL7.3 軟件包;InsightⅡ2005程序包(分子對(duì)接Dock程序、動(dòng)力學(xué)模擬Discover-3程序);篩選用數(shù)據(jù)庫為基于Specs小分子數(shù)據(jù)庫(2008)轉(zhuǎn)換的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(GOLDMAN);其他軟件有CVFF力場、Gromos 96力場;同源模建Homology;分子設(shè)計(jì)Ludi;靜電分布分析Delphi。

1.2 主要試劑 大腸桿菌 JM109、BL21、pET30a(+)載體由本室保存;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒(Promega);限制性內(nèi)切酶 Bgl II和 EcoR I(NEB)、Taq 酶、Pryobest酶、dNTPs、T4 DNA 連接酶(Takara);鎳離子親和層析柱(Invitrogen);PCR引物合成及DNA測序(華大蛋白);Anti-Mouse CD11c PE、Anti-Mouse CD11c(eBioscience);Super Polymer-二步法 IHC試劑盒、鼠 Streptavidin-HRP試劑盒、DAB顯色試劑盒(×20)、檸檬酸抗原修復(fù)液(×100)、改良型蘇木素等試劑均為(CWbio.Co.Ltd)

1.2 方法

1.2.1 小分子肽-GFP融合蛋白的表達(dá) 根據(jù)四個(gè)小分子肽和GFP目的基因序列，將小肽和連接臂進(jìn)行密碼子優(yōu)化，進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的引物如下:P1F:CATGCCATGGCAAGCAGTGAGAAGGCTGAACAACAGTGGGCTGGTTCTGGCAGCATG;P1M:CAGTGGGCTGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGCA GATCCTGAAGAAC;P2F:CATGCCATGGCAATTCGTCCTCAGCAGAACCGTGACAATGGTTCTGGCAGCATG;P2M:CGCGATAATGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;P3F:CATGCCATGGCAACTAACAACACACAACCTTTCGTGACAACCGGTTCTGG CAGCATG;P3M:GTGACAACCGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;P4F:CATGCCATGGCACACAATGGCAACGCAATCCAGTTGTGGCCAGGTTCTGGCAGCATG;P4M:TTGTGGCCAGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;GFP釣取引物;P5F:F:CATGCCATGGCAGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;R:GATATCTTATCTAGATCCGGTGGATCCCG;通過2次PCR將不同的肽與GFP連接到一起，將獲得的5個(gè)目的基因，用常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a(+)，酶切位點(diǎn)為Bgl II和EcoR I(NEB)，用鎳金屬離子螯合柱進(jìn)行純化并鑒定。

1.2.2 免疫效果評(píng)估 分別以0、14、28免疫程序給BALB/c小鼠舌下口服純化的四種融合蛋白和GFP 50 μg，每組6只，共6組30只鼠，雌雄各半。分別于初次和再次免疫后的次日免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP和CD11c在不同組織中的表達(dá)。所取組織分別用0.01 mol/L pH7.2 PBS洗滌2次，去除脂肪，研磨后用200目尼龍網(wǎng)過濾，取懸液1 500 r/min 5分鐘洗滌2次，取1×106細(xì)胞待用。實(shí)驗(yàn)時(shí)每管分別加 100 μl 0.01 mol/L pH7.2 PBS，根據(jù)抗體說明書加入抗體室溫孵育30分鐘，1 000 r/min離心5分鐘，棄上清，加500 μl PBS重懸后上機(jī);免疫組化按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 RTB與細(xì)胞特異性結(jié)合部位的確定

2.1.1 利用分子模擬技術(shù)搭建本課題組獲得的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)抗體3E1的輕、重鏈抗體空間構(gòu)象。

具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)抗體3E1重鏈氨基酸序列如下:SGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWIKQRPGHGLEWIGDILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSRSFYYNYDGAYFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC。

選擇同源性高的模板蛋白(PDB庫號(hào):2V7H)，進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果見圖1。

經(jīng)分子模擬、力學(xué)優(yōu)化獲得的抗體重鏈(VH+CH1)構(gòu)象(圖2)。

2.1.2 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)抗體3E1輕鏈的氨基酸序列如下:QMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDIKKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。類似地，對(duì)3E1輕鏈進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果見圖3。

圖1 高同源性模板蛋白(PDB庫號(hào):2V7H)，序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 Sequence comparison result with High Homologous templet protein(PDB:2V7H)

圖2 經(jīng)分子模擬、力學(xué)優(yōu)化獲得的抗體重鏈(VH+CH1)構(gòu)象Fig.2 Heavy chain conformation after molecular mimicry and mechanical optimization

圖3 對(duì)3E1輕鏈進(jìn)行序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 The result of sequence comparison of light chain 3E1

經(jīng)分子模擬、力學(xué)優(yōu)化獲得抗體輕鏈(VL+CL)構(gòu)象(圖4)。

圖4 經(jīng)分子模擬、力學(xué)優(yōu)化獲得的抗體輕鏈(VL+CL)構(gòu)象Fig.4 Light chain conformation after molecular mimicry and mechanical optimization

2.2 利用RTB結(jié)構(gòu)，通過抗原-抗體復(fù)合物之間的作用確定3E1與RTB復(fù)合物空間構(gòu)象。

2.2.1 利用分子對(duì)接及蛋白模板對(duì)3E1的Fab結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，并利用分子力學(xué)、動(dòng)力學(xué)優(yōu)化獲得其穩(wěn)定構(gòu)象(圖5)。

2.2.2 利用RicinB結(jié)構(gòu)，通過抗原-抗體作用復(fù)合物確定3E1與Ricin B復(fù)合物空間構(gòu)象(圖6)。

2.3 利用距離幾何學(xué)、分子間氫鍵以及 van der Waals相互作用，合理判定3E1識(shí)別RTB的活性區(qū)域，并推導(dǎo)出核苷酸序列。

利用距離幾何學(xué)、分子間氫鍵以及 van der Waals相互作用，合理判定3E1識(shí)別Ricin B的活性區(qū)域:SSEKAEQQWA;IRPQQNRDN;TNNTQPFVTT;HNGNAIQLWP。優(yōu)勢依次為 SSEKAEQQWA＞TNNTQPFVTT＞IRPQQNRDN＞HNGNAIQLWP。將篩選出的4個(gè)RTB與單抗特異性結(jié)合活性的部位，經(jīng)www.ncbi.nlm.nih.gov blast-P 序列比對(duì)，推導(dǎo)出 4個(gè)核苷酸序列。agc agt gaa aag gct gaa caa cag tgg gct;ata cgt cct cag caa aac cgc gat aat;act aat aat aca caa cct ttt gtg aca acc;cac aat gga aac gca ata cag ttg tgg cca。

2.4 初次免疫后GFP和CD11c在不同組織中的分布 四種小分子肽與GFP融合蛋白(P1-GFP～P4-GFP)分別免疫小鼠，初次免疫后次日，流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化分別檢測GFP和CD11c在不同組織中的分布。結(jié)果顯示GFP初次免疫后GFP主要分布于胃中(圖7、9)，P1-GFP初次免疫后GFP主要分布于空腸，結(jié)果與 GFP免疫組和其他3組(P2-GFP～P4-GFP)有明顯不同(圖8、9)。GFP在腸相關(guān)淋巴組織、腸系膜淋巴結(jié)和小腸PP結(jié)的分布實(shí)驗(yàn)組(P1-GFP～P4-GFP)和GFP對(duì)照組并無明顯差別。

圖5 抗體的Fab構(gòu)象飄帶結(jié)構(gòu)Fig.5 ribbon-like structure of Fab

圖6 蓖麻毒素B鏈與抗體的作用模式Fig.6 Pattern action of ricin toxin B with antibody

圖7 初次免疫后小鼠胃中GFP表達(dá)情況Fig.7 Expression of GFP in stomach after primary immunity

圖8 初次免疫后小鼠空腸中GFP表達(dá)情況Fig.8 Expression of GFP in jejunum after primary immunity

圖9 初次免疫后GFP在胃和空腸中的分布情況Fig.9 Expression of GFP in stomach and jejunum after primary immunity

圖10 初次免疫后CD11c在腸系膜淋巴結(jié)、胃和空腸中的分布情況Fig.10 Expression of CD11c in adenomesenteritis，stomach and jejunum after primary immunity

圖11 再次免疫后GFP在不同組織中的表達(dá)Fig.11 Expression of GFP in different tissures after secondary immunity

圖12 再次免疫后CD11c在不同組織中的表達(dá)Fig.12 Expression of CD11c in different tissures after secondary immunity

初次免疫后P1-GFP免疫組CD11c+細(xì)胞主要分布于在腸系膜淋巴結(jié)中，與GFP免疫組和其他3組(P2-GFP～P4-GFP)有明顯的不同，此外，P1-GFP免疫組CD11c+細(xì)胞在空腸中也有較高的表達(dá)(圖10)。

2.5 再次免疫后GFP和CD11c在不同組織中的分布 再次免疫后次日，分別取小鼠胃、腸相關(guān)淋巴組織、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、小腸PP結(jié)、回腸、空腸等組織，分別用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示再次免疫后，小鼠脾臟、胃和空腸中，GFP免疫組與GFP肽融合蛋白組(P1-GFP～P4-GFP)GFP表達(dá)無明顯差別。再次免疫后，P1-GFP免疫組GFP在腸相關(guān)淋巴組織(D)、回腸(F)和小腸(G)的表達(dá)明顯高于GFP免疫組和其他肽GFP融合蛋白組(P2-GFP～P4-GFP);腸系膜淋巴結(jié)中GFP免疫組GFP的表達(dá)與肽GFP融合蛋白組(P1-GFP～P2-GFP)也有明顯的差異(圖11)。

再次免疫后，P1-GFP免疫組 CD11c在空腸(H)的表達(dá)明顯高于GFP免疫組和其他肽GFP融合蛋白組(P2-GFP～P4-GFP)(圖12)，P1-GFP免疫組CD11c在脾臟和腸系膜淋巴結(jié)也有一定表達(dá)。腸相關(guān)淋巴組織、小腸PP結(jié)、胃、回腸等組織，GFP組與GFP肽融合蛋白組(P1-GFP～P4-GFP)CD11c表達(dá)無明顯差別。

3 討論

機(jī)體約有95%以上的感染發(fā)生在黏膜或由黏膜侵入機(jī)體，由此引起的黏膜損傷及黏膜免疫功能的紊亂，常成為自身免疫性疾病或機(jī)會(huì)感染發(fā)生的重要誘因，因此，防治黏膜感染在人類健康中占有舉足輕重的地位［13］。

雖然機(jī)體黏膜免疫的機(jī)制還不完全清楚。但由于目前使用抗原的免疫原性普遍較弱，使基于黏膜免疫疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間短，免疫保護(hù)效果不佳。研究和開發(fā)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期、高效和持久免疫應(yīng)答的、黏膜免疫佐劑已成為感染免疫和疫苗領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

蓖麻毒素(ricin)是由A、B兩條多肽鏈通過二硫鍵連接成的異二聚體。A鏈(RTA)為效應(yīng)鏈，具糖苷酶活性，有使核糖體失活的能力。B鏈(RTB)為結(jié)合鏈，含有兩個(gè)半乳糖結(jié)合部位，幾乎能與所有真核細(xì)胞上含半乳糖基的糖蛋白或糖酯結(jié)合。A鏈只有在B鏈的幫助下，才能定位于細(xì)胞表面，并穿過細(xì)胞膜破壞其核蛋白體60s亞單位，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

由于RTB與巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的這一獨(dú)特性質(zhì)，有學(xué)者在黏膜免疫疫苗的研制中使用RTB將抗原直接靶向抗原呈遞細(xì)胞，并取得了良好的免疫效果。雖然RTB不同組分融合蛋白激發(fā)的免疫應(yīng)答類型不盡相同，其作用機(jī)理也不清楚，但所有結(jié)果均提示RTB及有效組分可以作為激發(fā)全身和黏膜免疫反應(yīng)的有效佐劑。由于RTB與細(xì)胞的結(jié)合可引起非特異性毒性［14］，因此如何減低其毒性并保留活性成分，闡明RTB及有效組分在免疫應(yīng)答中的作用機(jī)理，對(duì)研制基于RTB及有效組分的黏膜免疫疫苗尤為重要。

本研究中我們利用本實(shí)驗(yàn)室獲得的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的RTB中和性單抗3E1的空間構(gòu)象，應(yīng)用距離幾何學(xué)、分子間氫鍵以及van der Waals相互作用，合理判定3E1識(shí)別RTB的四個(gè)活性區(qū)域，并推導(dǎo)出對(duì)應(yīng)的核苷酸序列和氨基酸序列，試圖通過小分子肽的導(dǎo)向作用，將目的蛋白靶向單核巨噬細(xì)胞特別是樹突狀細(xì)胞，以激發(fā)有效的免疫應(yīng)答。通過構(gòu)建含不同肽的綠色熒光蛋白原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了四個(gè)小分子肽GFP融合蛋白在大腸桿菌中的高效、可溶性表達(dá)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四個(gè)小分子肽GFP融合蛋白(P1-GFP～P4-GFP)免疫小鼠后，P1-GFP免疫組GFP和CD11c在不同組織中的分布與GFP免疫組和其他3個(gè)肽GFP融合蛋白(P2-GFP～P4-GFP)免疫組有明顯的區(qū)別。P1-GFP融合蛋白初次免疫小鼠后經(jīng)P1肽的導(dǎo)向，GFP主要分布于空腸，而未經(jīng)導(dǎo)向的GFP免疫組，初次免疫后GFP主要分布于胃。提示P1-GFP融合蛋白中融合的小分子肽在黏膜免疫中發(fā)揮了導(dǎo)向作用，使抗原直接進(jìn)入小腸進(jìn)而引發(fā)初次免疫應(yīng)答。再次免疫后，小鼠體內(nèi)GFP分布與初次免疫后也有明顯不同，GFP分布范圍更廣，GFP在P1肽的導(dǎo)引下主要集中于回腸、腸相關(guān)淋巴組織和小腸PP結(jié)。研究結(jié)果進(jìn)一步證明了小分子肽的導(dǎo)向作用，使GFP直接進(jìn)入小腸PP結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)兩個(gè)黏膜免疫應(yīng)答的主要誘導(dǎo)及效應(yīng)部位。由于小腸PP結(jié)在淋巴組織中解剖部位上具有獨(dú)特性，即有傳出淋巴管，無傳入淋巴管，小分子肽可將GFP等抗原直接帶到免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)部位，利于免疫應(yīng)答的發(fā)生。P1-GFP融合蛋白初次免疫小鼠后小鼠體內(nèi)的樹突狀細(xì)胞即CD11c+細(xì)胞主要分布于腸系膜淋巴結(jié)，在空腸中也有較高表達(dá)。再次免疫后小鼠體內(nèi)的樹突狀細(xì)胞分布發(fā)生了改變，腸系膜淋巴結(jié)中的CD11c+細(xì)胞不再占優(yōu)勢，而是空腸中CD11c+細(xì)胞明顯增加。提示再次免疫后腸道的樹突狀細(xì)胞分布發(fā)生了改變，主要集中于易于抗原接觸的部位，利于免疫應(yīng)答的發(fā)生。至于P1-GFP融合蛋白免疫效果如何有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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