王 剛 王海燕 張 華 賀菊香 吉利賓 楊歆睿 (青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，西寧 810001)

雪靈芝(Arenaria kansuensis)為青藏高原特有的石竹科蚤綴屬草本植物，分布于海拔4 000米以上的高山草甸和礫石帶。雪靈芝的藏藥名為“阿仲嘎保”，意為“采天地靈氣之人間仙草”，以全草入藥。據(jù)藏醫(yī)典籍記載雪靈芝具有“治療胃腸之潰瘍、膨脹、癌癥、瘰疬并能健胃助消”［1］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)研究表明，雪靈芝具有抗炎、抗氧化、促消化以及對(duì)二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌具有預(yù)防作用［2-5］。本研究組的前期研究顯示，在一定的濃度范圍內(nèi)，雪靈芝水提物對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞系，具有增殖抑制作用。本文通過(guò)觀察雪靈芝水提物對(duì)體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平以及小鼠脾淋巴細(xì)胞和人PBMC中Th1型細(xì)胞因子表達(dá)的影響，探索雪靈芝是否對(duì)發(fā)揮抗腫瘤作用的免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子具有激活作用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動(dòng)物與細(xì)胞 清潔級(jí)昆明小鼠，4～6周齡，體重(20±2)克，購(gòu)自青海省地病所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;健康人外周血采自研究組工作人員。

1．1．2 主要試劑與儀器 雪靈芝水提物凍干粉劑由本實(shí)驗(yàn)室制備，凍干粉劑用PBS溶解(濃度4 mg/ml);四氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司;刀豆蛋白(ConA)、植物血凝素(PHA)及二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司;紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;小鼠IL-2與IFN-γ的ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience公司;Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司;SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司;熒光定量PCR儀(FQD-48A型，杭州博日科技有限公司);酶標(biāo)儀(Rayto RT-6000型，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液制備 頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡，無(wú)菌條件下分離脾臟，置皿中剔除脂肪和結(jié)締組織，將脾組織研碎后用生理鹽水混懸，經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，1 500 r/min離心5分鐘后棄上清，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，置冰上裂解1分鐘，4℃離心棄上清后重復(fù)裂解一次，用含2%小牛血清Hank's液洗滌離心細(xì)胞兩次，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)細(xì)胞活力≥95%，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基按2×106cells/ml制備細(xì)胞懸液。

1．2．2 四氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖 按100μl/孔接種小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板，各孔加入含ConA(終濃度1μg/ml)培養(yǎng)液50μl;各處理組每孔加入含相應(yīng)濃度雪靈芝水提物的培養(yǎng)液50μl，對(duì)照組(0 mg/ml組)加入等量培養(yǎng)液，每組設(shè)5復(fù)孔。37℃ 5%CO2培養(yǎng)44小時(shí)，每孔加20μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。小心吸棄上清，各孔加入150μl DMSO，振蕩溶解5分鐘，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)OD值，結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)表示:SI=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值。

1．2．3 體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中IL-2及IFN-γ水平檢測(cè) 按1 ml/孔接種小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液于24孔培養(yǎng)板，各孔加終濃度為1μg/ml的ConA;處理組加入相應(yīng)濃度雪靈芝水提物，對(duì)照組(0 mg/ml組)加入等量培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時(shí)后離心收集培養(yǎng)上清，－70℃保存待測(cè)。IL-2及 IFN-γ ELISA檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1．2．4 人PBMC中Th1細(xì)胞因子mRNA表達(dá)檢測(cè)健康人外周靜脈血經(jīng)60%Percoll密度梯度離心，分離人PBMC，PBS洗滌2次，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106ml－1，按2 ml/孔，接種于6孔板，各孔加入終濃度5μg/ml的PHA。處理孔加入相應(yīng)濃度雪靈芝水提物，對(duì)照孔(0 mg/ml)加入等量培養(yǎng)液。培養(yǎng)8小時(shí)后收集細(xì)胞，Trizol法抽提總RNA并合成cDNA第一鏈。配制25 μl PCR 反應(yīng)體系:ddH2O 16 μl，10×PCR 緩沖2．5 μl，dNTP Mix(Each 2．5 mmol/L)2 μl，MgCl2(25 mmol/L)1．5 μl，Taq 酶(5 U/μl)0．2 μl，cDNA 1 μl、上、下游引物(表 1，10 μmol/L)各 1 μl;經(jīng)94℃變性5分鐘，94℃ 30秒，55℃ 45秒，72℃ 45秒擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)，72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳并觀察拍照。配制20μl熒光定量 PCR體系:ddH2O 7μl，2×QuantiFast SYBR Green PCR 預(yù)混液 10 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物(10μmol/L)各1μl。按95℃變性5分鐘，95℃ 15秒，60℃ 45秒(測(cè)熒光1次)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán);之后從60℃至95℃，以0．2℃臺(tái)階升溫，進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。各組樣品設(shè)3復(fù)孔，以管家基因GAPDH為內(nèi)參照，以對(duì)照組作標(biāo)準(zhǔn)校比，2－ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 α=0．05。

表1 引物序列與產(chǎn)物大小Tab．1 Primer sequence and product size

2 結(jié)果

2．1 雪靈芝水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，0．05～0．4 mg/ml雪靈芝水提物處理組 SI高于對(duì)照組(P＜0．05)，同時(shí)0．025 ～0．4 mg/ml處理組 SI高于 0．8 mg/ml組(P＜0.05)，其中 0．2 mg/ml組 SI為 1．98±0．51(圖1)。

2．2 雪靈芝水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌Th1型的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，0．05～0．1 mg/ml雪靈芝水提物處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2水平明顯高于對(duì)照組(P＜0．05);而 0．4 mg/ml雪靈芝水提物處理組IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組(P＜0．05，表2)。

圖1 雪靈芝水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig．1 The effect of AKAE on proliferation of mice spleen lym phocytes

表2 不同濃度雪靈芝水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2及 IFN-γ 的影響 (pg/m l， ±s，n=5)Tab．2 The effect of different concentration AKAE on IL-2 and IFN-γ production of mice spleen lym phocytes(pg/m l， ±s，n=5)

表2 不同濃度雪靈芝水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2及 IFN-γ 的影響 (pg/m l， ±s，n=5)Tab．2 The effect of different concentration AKAE on IL-2 and IFN-γ production of mice spleen lym phocytes(pg/m l， ±s，n=5)

Note:Compared with 0 mg/ml group，1)P＜0．05．

Concentration(mg/ml) IL-2 IFN-γ 0 55．88±7．20 29．11±4．67 0．05 155．9±29．641) 42．37±6．82 0．1 371．95±82．111) 45．68±9．11 0．2 32．47±5．59 48．93±9．37 0．4 19．32±4．53 87．70±16．541)

2．3 雪靈芝水提物對(duì)人PBMC中 NF-κB p65、IL-2及IFN-γmRNA表達(dá)的影響 RT-PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的 NF-кB p65、IL-2及 IFN-γ 條帶;熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，0．2mg/ml雪靈芝水提物處理組IL-2 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高;0.1 mg/ml和0．2 mg/ml處理組 NF-кB p65 及 IFN-γmRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。0．2 mg/ml處理組的 NF-кB p65、IL-2及 IFN-γ 相對(duì)表達(dá)量，分別為185．75±19．7、4．31±0．05 和 36．67±5．48。熔解曲線(xiàn)分析顯示，3種擴(kuò)增產(chǎn)物峰值單一，說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體和非特異性條帶形成(圖2)。

3 討論

雪靈芝的藥用研究始于上世紀(jì)末，國(guó)內(nèi)研究者進(jìn)行的植化研究顯示，雪靈芝含有多糖、三萜皂苷、β-咔波啉生物堿及環(huán)肽等活性物質(zhì)［6］。在免疫相關(guān)的研究方面，彭寶珠等［2］通過(guò)巴豆油致小鼠耳腫脹、蛋清/角叉菜膠致大鼠足腫脹等炎癥模型以及觀察小鼠胸腺、脾臟及淋巴結(jié)重量變化的實(shí)驗(yàn)研究，顯示雪靈芝具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用;李鳳文等［7］研究報(bào)道，雪靈芝具有促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖、增強(qiáng)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)和小鼠血清溶血素水平以及增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力等免疫增強(qiáng)作用。

本課題組之前進(jìn)行的體外抑瘤研究顯示，雪靈芝水提物在0．1～0．8 mg/ml濃度范圍，對(duì)體外培養(yǎng)人胃癌MG803細(xì)胞增殖呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性抑制效應(yīng)，IC50=(0．134±0．005)mg/ml(另文報(bào)道)。由此，本文為了解雪靈芝水提物在上述抑瘤有效濃度下，是否對(duì)與機(jī)體抗腫瘤免疫密切相關(guān)的淋巴細(xì)胞增殖和Th1型細(xì)胞因子表達(dá)具有促進(jìn)作用，進(jìn)行了探索。

首先，淋巴細(xì)胞中Th1型T細(xì)胞亞群通過(guò)產(chǎn)生IL-2、IFN-γ及IL-12等細(xì)胞因子，對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能、DC細(xì)胞成熟、NK細(xì)胞與CTL細(xì)胞毒作用發(fā)揮正性調(diào)節(jié)，是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要執(zhí)行者。本研究顯示，在0．025～0．4 mg/ml濃度范圍，雪靈芝對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有明顯促進(jìn)作用。其中0．025～0．2 mg/ml處理組 SI呈濃度依賴(lài)性升高，0.2 mg/ml組SI達(dá)1．98;然而，隨雪靈芝作用濃度進(jìn)一步增加，小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，0．8 mg/ml處理組 SI僅為 0．82，明顯低于其他處理組。這種藥物作用濃度與細(xì)胞增殖水平之間的非線(xiàn)性關(guān)系，提示雪靈芝對(duì)淋巴細(xì)胞增殖可能具有與濃度高低密切相關(guān)的雙向調(diào)節(jié)作用。

圖2 雪靈芝水提物對(duì)人PBMC中IL-2及IFN-γm RNA表達(dá)的影響Fig．2 The effect of AKAE on m RNA expression of p65，IL-2 and IFN-γ in human PBMC

其二，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，在小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中，0．5 mg/ml和 0．1 mg/ml組 IL-2 水平、0．4 mg/ml組IFN-γ水平均高于對(duì)照組;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，0．2 mg/ml處理組人PBMC的IL-2 mRNA表達(dá)明顯升高，0．1～0．2 mg/ml組人 PBMC的IFN-γ和p65 mRNA表達(dá)顯著升高。由于p65蛋白是構(gòu)成核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的主要亞基，p65的升高可促進(jìn)NF-κB核轉(zhuǎn)位，在Th0細(xì)胞向Th1分化及表達(dá) IL-2、IFN-γ的過(guò)程中具有正反饋調(diào)節(jié)作用［8-10］。提示雪靈芝可能通過(guò) NF-κB信號(hào)通路，糾正Th1/Th2偏移，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫。

綜合上述淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子表達(dá)的研究結(jié)果，我們認(rèn)為，0．05 ～0．4 mg/ml是雪靈芝激活淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)Th1細(xì)胞因子表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫的最佳效應(yīng)濃度范圍，而這一范圍與我們前述的體外抑瘤效應(yīng)濃度高度重合。這為進(jìn)一步開(kāi)展荷瘤鼠研究，探討雪靈芝是否具有體內(nèi)腫瘤抑制與免疫激活雙重作用，提供了依據(jù)。

1 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所．藏藥志［M］．西寧:青海人民出版社，1991:449．

2 彭寶珠，馮偉力，王利彥et al．藏藥雪靈芝對(duì)炎癥和免疫功能的影響［J］．中國(guó)中藥雜志，1991;16(6):363-366，383．

3 付 翔，陳 薇，段小群et al．雪靈芝提取物清除羥自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用［J］．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010;17(7):35-36．

4 姚思宇，趙 鵬，劉榮珍et al．西藏雪靈芝促進(jìn)消化作用實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2007;23(3):332-333，364．

5 趙 鵬，姚思宇，王彥武et al．雪靈芝對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌組織細(xì)胞的抑制作用［J］．中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007;11(38):7553-7555．

6 雷 寧，杜樹(shù)山，李 林et al．藏藥甘肅蚤綴的化學(xué)成分研究Ⅰ［J］．中國(guó)中藥雜志，2007;32(10):918-920．

7 李鳳文，趙 鵬，劉榮珍et al．雪靈芝調(diào)節(jié)小鼠免疫功能作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2007;7(11):1999-2000，2020．

8 Corn R A， Aronica M A，Zhang F et al．T cell-Intrinsic requirement for NF-кB induction in postdifferentiation IFN-γ production and clonal expansion in a Th1 response［J］．J Immunol，2003;171(4):1816-1824．

9 Ozato K，Tsujimura H，Tamura T．Toll-like receptor signaling and regulation of cytokine gene expression in the immune system［J］．Biotechniques，2002;10:66-68，70，72．

10 Lederer JA，Liou JS，Kim S et al．Regulation of NF-kappa B activation in T helper 1 and T helper 2 cells［J］．J Immunol，1996;156(1):56-63．