董 超，劉 迪，馮業(yè)童，劉朋飛，吳 璇，吳昊昱，周余來(lái)

（吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021）

結(jié)直腸癌細(xì)胞外泌體的制備及其促單核細(xì)胞增殖作用

董 超，劉 迪，馮業(yè)童，劉朋飛，吳 璇，吳昊昱，周余來(lái)

（吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021）

目的：從結(jié)直腸癌細(xì)胞系中分離鑒定外泌體，初步研究結(jié)直腸癌來(lái)源的外泌體潛在的免疫學(xué)特性，為外泌體在結(jié)直腸癌免疫學(xué)治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。方法：超速離心法從HCT116和SW480 2種結(jié)直腸癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清中分離提取正常細(xì)胞外泌體和熱休克細(xì)胞外泌體，進(jìn)一步用220nm的濾膜進(jìn)行純化獲得純度較高的外泌體。采用透射電鏡觀察所提取外泌體表征形態(tài)，聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析細(xì)胞和外泌體的蛋白組成，檢測(cè)外泌體促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的增殖功能。結(jié)果：透射電鏡下正常的外泌體和細(xì)胞熱休克獲得的外泌體形態(tài)相近，均呈現(xiàn)典型的圓形或橢圓形外泌體結(jié)構(gòu)，直徑為50～100nm。聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)直腸癌細(xì)胞裂解物與結(jié)直腸癌細(xì)胞系來(lái)源外泌體的蛋白組成不同，與未處理和經(jīng)熱休克處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞比較，外泌體對(duì)PBMCs的增殖有更強(qiáng)的促進(jìn)作用（P＜0.05），熱休克作用可使外泌體誘導(dǎo)的PBMCs的增殖程度顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論 ：超速離心法和濾膜過(guò)濾方法可有效地從結(jié)直腸癌細(xì)胞系中提取外泌體，細(xì)胞裂解物和外泌體的蛋白組成差異可能是造成免疫學(xué)特性差異的主要原因，將細(xì)胞經(jīng)熱休克處理可增強(qiáng)外泌體的免疫原性。

結(jié)直腸腫瘤；外泌體；熱休克；免疫治療

胃腸道惡性腫瘤中結(jié)直腸癌發(fā)病率僅次于胃癌和食道癌，發(fā)病率較高，且近年來(lái)發(fā)病率仍呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)［1］。盡管手術(shù)治療和相應(yīng)的輔助治療方法發(fā)展較快，但患者的術(shù)后存活率并沒(méi)有得到顯著改善［1－2］。與傳統(tǒng)治療方法比較，腫瘤免疫治療通過(guò)提高自身免疫力殺死腫瘤細(xì)胞，不僅副作用小而且更加安全，已成為最具潛力的結(jié)直腸癌治療方法［3］。外泌體是一種可由多種細(xì)胞分泌的膜泡結(jié)構(gòu)，來(lái)自于細(xì)胞的多泡內(nèi)含體。不同來(lái)源的外泌體具有與來(lái)源相關(guān)的特殊功能［4］。普遍存在于不同來(lái)源外泌體的蛋白有黏附蛋白和熱休克蛋白等，這些蛋白在外泌體介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用。外泌體表面的蛋白可通過(guò)抗原提呈細(xì)胞被T細(xì)胞識(shí)別并激活免疫系統(tǒng)［5－6］。因此腫瘤細(xì)胞分泌外泌體被認(rèn)為是提呈腫瘤抗原的載體，在腫瘤免疫治療中具有巨大的應(yīng)用前景［7－8］。本研究分離鑒定了結(jié)直腸癌細(xì)胞系來(lái)源的外泌體并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行了初步探討，特別是外泌體與細(xì)胞在高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白方面的差異，可能是二者促單核細(xì)胞增殖能力不同的原因。類似研究在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480細(xì)胞株由吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心提供；DMEM高糖培養(yǎng)、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶、對(duì)鈉十二烷基硫酸鹽（SDS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK－8試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；JEM－2000EX透射電子顯微鏡購(gòu)自日本電子公司，OptimaTM LE－80K低溫超速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞于43℃處理1h后恢復(fù)常規(guī)培養(yǎng)，進(jìn)行熱休克處理。人外周血采自健康獻(xiàn)血志愿者，通過(guò)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞系來(lái)源的外泌體的分離 在培養(yǎng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%后，PBS洗2遍，在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，通過(guò)3次離心去除細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，條件分別是300g離心10min，1 200g離心20min，10 000g離心30min。然后在100 000g離心60min的超速離心條件下外泌體聚集至管底，用PBS重懸洗滌1次，最終的沉淀通過(guò)220nm濾膜過(guò)濾獲得純度較高的外泌體，保存溫度為－80℃。

1.4 外泌體超微形態(tài)的觀察 將從細(xì)胞培養(yǎng)液上清中超離獲得的外泌體加在銅網(wǎng)上，被吸附在銅網(wǎng)上的外泌體被2%的磷酸鎢酸染色并在透射電鏡下觀察其形態(tài)。

1.5 蛋白濃度的測(cè)定 結(jié)直腸癌細(xì)胞系和分離的外泌體在蛋白裂解液中裂解。加入裂解液后充分混勻，置于冰上30min，100℃、10min，然后15 000r·min－1離心20min去除細(xì)胞碎片。用二喹啉甲酸（BCA）方法測(cè)定蛋白濃度。相同質(zhì)量的細(xì)胞蛋白和外泌體通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色。分離膠濃度為12%。

1.6 共培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）增殖率測(cè)定 將外周血單個(gè)核細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞蛋白裂解液和結(jié)直腸癌細(xì)胞系來(lái)源的外泌體共培養(yǎng)。外周血單個(gè)核細(xì)胞的濃度為2×106mL－1，細(xì)胞蛋白和外泌體濃度為200mg·L－1。PBMCs和蛋白樣品均在培養(yǎng)基中重懸，各組體積一致，均為200μL（表1）。共培養(yǎng) 60h 后，采用 CCK－8 法測(cè)定PBMCs增殖率。增殖率與絕對(duì)吸光度（A）值成正比。細(xì)胞增殖率＝（各實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組單核細(xì)胞A值以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

表1 PBMCs共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分組方案Tab.1 Grouping plan of PBMCs in co－culture experiment

2 結(jié) 果

2.1 透射電鏡下結(jié)腸癌細(xì)胞系來(lái)源外泌體的形態(tài)學(xué)特征 在透射電鏡下可觀察到超速離心獲得的沉淀由直徑約100nm的膜泡結(jié)構(gòu)組成。熱休克處理后細(xì)胞分泌的外泌體與未處理細(xì)胞分泌的外泌體均為圓形或橢圓形，形態(tài)較為相近。見(jiàn)圖1。

圖1 透射電鏡下未處理細(xì)胞和熱休克結(jié)直腸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體的形態(tài)學(xué)（×80 000）Fig.1 The morphology of exosomes from untreated and heat shock treated colorectal carcinoma cells under transmission electron microscope（×80 000）

2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞全蛋白與外泌體全蛋白一維變性凝膠電泳 正常外泌體和經(jīng)熱休克處理的外泌體在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有著相近的蛋白條帶，將相同含量的外泌體（10μg）和細(xì)胞全蛋白 （10μg）分別加入加樣孔進(jìn)行電泳。正常細(xì)胞和熱休克處理細(xì)胞的電泳結(jié)果中蛋白條帶同樣相近 （圖2A和B）。然而細(xì)胞全蛋白與外泌體比較在電泳條帶上差別較大，尤其是相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白條帶。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果通過(guò)Quantity One 4.62 furthermore分析，外泌體中相對(duì)分子質(zhì)量高的蛋白含量較細(xì)胞系中相對(duì)分子質(zhì)量高的蛋白含量更多，而相對(duì)低分子質(zhì)量蛋白條帶相近 （圖2C和D）。

2.3 共培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 與未處理和經(jīng)熱休克處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞比較，外泌體對(duì)PBMCs的增殖有更強(qiáng)的促進(jìn)作用 （P＜0.05）。結(jié)直腸癌細(xì)胞系和外泌體的PBMCs增殖能力均可通過(guò)熱休克加強(qiáng)。見(jiàn)表2。

3 討 論

外泌體是由包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌的膜泡結(jié)構(gòu)，包含多種膜蛋白和胞質(zhì)蛋白，這種外泌體在多種體液中都有存在［9］，在腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。很多與腫瘤遷移信號(hào)通路相關(guān)的蛋白均存在于腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中，從而傳遞信號(hào)導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移等惡性表型［10］，有報(bào)道［11－12］表 明：外 泌 體 同 時(shí) 可 以 傳 遞 mRNA 和 miRNA。

圖2 結(jié)直腸癌細(xì)胞全蛋白和對(duì)應(yīng)來(lái)源外泌體全蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoregram of SDS－PAGE of full proteins of colorectal carcinoma cells and matching exosomes

表2 不同腫瘤抗原刺激物作用下PBMCs增殖結(jié)果Tab.2 Proliferation results of PBMCs stimulated with different tumor antigens （±s）

表2 不同腫瘤抗原刺激物作用下PBMCs增殖結(jié)果Tab.2 Proliferation results of PBMCs stimulated with different tumor antigens （±s）

＊P＜0.05 vs HCT116group；△P＜0.05 vs SW480group；＃P＜0.05 vs HCT116exsomes group；▲P＜0.05 vs SW480 exosomes group.

Group A value HCT116 0.233±0.018 HS－HCT116 0.308±0.026＊HCT116exosomes 0.417±0.013＊HCT116HS－exosomes 0.462±0.011＊＃SW480 0.305±0.011 HS－SW480 0.412±0.021△SW480exosomes 0.504±0.007△SW480HS－exosomes 0.612±0.013△▲Positive 1.169±0.116 Negative 0.195±0.014

研究［13－14］顯示：結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW1116 、COLO205）也可分泌外泌體。同樣，細(xì)胞全蛋白和外泌體全蛋白在一維變形凝膠電泳中，相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白條帶有較大差異，而這些蛋白極有可能與刺激免疫系統(tǒng)和促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究分離了熱休克結(jié)直腸癌細(xì)胞系分泌的外泌體。熱休克處理的2種細(xì)胞系來(lái)源的外泌體在形態(tài)上與正常外泌體相近，然而分子組成分析顯示了量的差異。這些差異正是由于熱休克來(lái)源外泌體比正常外泌體存在更多免疫分子導(dǎo)致的［15－17］。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明了外泌體能誘導(dǎo)PBMCs增殖。

綜上所述，基于在制備和應(yīng)用上的簡(jiǎn)單可行，與傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞抗原比較，熱休克外泌體在腫瘤免疫治療中有更大的優(yōu)勢(shì)，特別是腫瘤免疫治療的低毒副作用、治療效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，使這項(xiàng)新技術(shù)具有更廣闊的臨床應(yīng)用空間。

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Preparation of exosomes derived from colorectal carcinoma cells and their effects of promoting proliferation on mononuclear cells

DONG Chao，LIU Di，F(xiàn)ENG Ye－tong，LIU Peng－fei，WU Xuan，WU Hao－yu，ZHOU Yu－lai
（Biological Engineering Experiment Center，Jilin University，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To separate and identify the exosomes from colorectal carcinoma cells and to preliminarily study their immunological characteristics，and to provide basis for the application of exosomes in colorectal carcinoma immunotherapy.Methods The normal exosomes and heat shock exosomes of HCT116and SW480cells were separated by ultracentrifugation and purified by 220nm microspore film.The morphology of exosomes were observed under transmission electron microscope.The protein compositions of cells and exosomes were analyzed by SDS－PAGE method.The promoting function of exosomes in proliferation of peripheral blood monouclear cells（PBMCs）was detected.Results Under transmission electron microscope，the normal exosomes and heat shock exosomes had similar appearance.They were either spherical or oval membrane vesicles，whose diameters were about 50－100nm.The results of SDS－PAGE showed the differences of protein compositions between colorectal cell lysates and exosomes derived from colorectal carcinoma cells.Compared with untreated and heat shock treated colorectal carcinoma cells，the exosomes had stronger promotion effect on PBMCs proliferation（P＜0.05）.The proliferaton of PBMCs could be reinforced with heat shock（P＜0.05）.Conclusion For separation and identification of the exosomes derived from colorectal carcinoma cells，the method of ultracentrifugation and filtration is simple and feasible.The differences of protein composition between colorectal cell lysates and exosomes may be the major reason of their differences in immunological characteristics.The immuogenicity of exosomes could be enhanced by treating the cells with heat shock.

colorectal neoplasms；exosome；heat shock；immunotherapy

R735.3

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0472－05

10.7694／jldxyxb20130310

2012－10－10

吉林省衛(wèi)生廳科研基金資助課題 （2009Z043）；吉林大學(xué)博士研究生交叉學(xué)科科研基金資助課題 （2011J023）

董 超 （1989－），男，吉林省松原市人，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事腫瘤免疫學(xué)方面的研究。

周余來(lái) （Tel：0431－85619299，E－mail：zhouyl＠jlu.edu.cn）

時(shí)間：2013－04－23 18：40

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20130423.1840.001.html